乙型肝炎病毒HBx蛋白的表達(dá)純化及全基因組蛋白與宿主蛋白之間相互作用組模型的建立.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生的主要原因之一,而HBV相關(guān)的HCC排名十大癌癥之一。在目前,全世界HBV慢性感染患者有兩億人,因此,HBV對(duì)人類的健康仍然是嚴(yán)重的威脅。盡管HBV相關(guān)肝癌的致病機(jī)理仍然不清楚,但有證據(jù)表明,HBx蛋白在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要的作用。HBx蛋白是一種多功能的調(diào)節(jié)因子,它直接或間接地通過與宿主蛋白的相互作用參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、蛋白降解、細(xì)胞凋亡和遺傳穩(wěn)定。<

2、br>　　 HBV的HBx基因編碼154個(gè)氨基酸,大小為17KD。這些氨基酸殘基中的九個(gè)半胱氨酸殘基對(duì)HBx蛋白的結(jié)構(gòu)具有十分重要的作用,前八個(gè)半胱氨酸殘基形成四對(duì)二硫鍵,分別是Cys7和Cys78,Cys17和Cys115,Cys61和Cys137,Cys69和Cys143,而Cys148是游離的。每個(gè)半胱氨酸殘基與其后面的第四個(gè)半胱氨酸殘基形成二硫鍵而最后一個(gè)半胱氨酸殘基又是游離的,這樣的特殊結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致復(fù)性后HBx蛋白在溶液中

3、存在多態(tài)性的原因。在用大腸桿菌表達(dá)完整的HBx蛋白或截?cái)嗟腍Bx蛋白時(shí),得到的目的蛋白總是以包涵體的形式存在,后期純化還需要變性和復(fù)性,這對(duì)HBx蛋白的天然結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。但是在使用大腸桿菌表達(dá)出來的經(jīng)過變性復(fù)性的HBx蛋白做功能試驗(yàn)時(shí),它仍然具有與RNA和人的P53蛋白結(jié)合的活性。這說明了大腸桿菌表達(dá)出來的HBx蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)上是完全正確的并具有HBx蛋白在細(xì)胞中的一些功能。在用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HBx蛋白時(shí),它在昆蟲細(xì)胞

4、中有兩種存在狀態(tài),一種是微量的可溶性狀態(tài),一種是大量的聚集狀態(tài)。在后期的表達(dá)純化時(shí),也涉及到了變性和復(fù)性,而在使用核磁共振驗(yàn)證HBx蛋白的二硫鍵是否正確折疊時(shí),發(fā)現(xiàn)復(fù)性的HBx蛋白只有三對(duì)二硫鍵。因此,不論是用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)還是用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),存在的主要問題就是要能大規(guī)模表達(dá)出正確折疊的可溶性的HBx蛋白。
　　 為了能表達(dá)出可溶性的HBx蛋白,選擇合適的表達(dá)質(zhì)粒和宿主菌是成功的關(guān)鍵。在大腸桿菌和桿狀病毒系統(tǒng)中使用GS

5、T和His標(biāo)簽融合到HBx的N端,表達(dá)出來的融合蛋白均是包涵體。我們選擇了pET32a、pQE30和pMAL-c2x質(zhì)粒作為表達(dá)質(zhì)粒,其中在pMAL-c2x質(zhì)粒上攜帶了麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽,pQE30質(zhì)粒上攜帶了His標(biāo)簽和pET32A質(zhì)粒攜帶了Trx、S和His標(biāo)簽。我們把這些構(gòu)建了HBx基因的表達(dá)質(zhì)粒分別在BL21(DE3)、TB1和JM109菌株中表達(dá),預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,只有攜帶HBx基因的pMAL-c2x質(zhì)粒在JM109菌

6、株表達(dá)的融合蛋白才是可溶的,而在BL21(DE3)菌株中部分融合蛋白是可溶的,在TB1菌株中不表達(dá)。這說明了MBP標(biāo)簽對(duì)HBx蛋白在細(xì)菌中表達(dá)的可溶性有一定的幫助。我們培養(yǎng)了15L的細(xì)菌,收集菌體后超聲破碎,然后通過離心,上親和樹脂柱和離子交換柱,純化出了60mg的融合蛋白。通過Factor Xa蛋白酶酶切,48小時(shí)后,發(fā)現(xiàn)溶液中有類似膠體的沉淀。通過分析發(fā)現(xiàn)HBx蛋白的PI為8.6,MBP的PI為4.9,MBP-HBx蛋白的PI為6.

7、1,而溶液的PH為8.0,因此我們通過PH值調(diào)節(jié),發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液PH值為10.0時(shí),白色膠狀體消失,溶液變澄清。為了能增加蛋白的可溶性,我們?cè)谕肝雒盖挟a(chǎn)物時(shí)加入了1M Urea和0.05％SDS,然后再通過凝膠柱來分離這三個(gè)蛋白。通過凝膠柱分離后,目的蛋白HBx的濃度為0.5mg/ml。這為研究HBx蛋白的結(jié)構(gòu)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 HBV感染在全世界是肝臟癌癥發(fā)生的最普通的原因,它主要通過體液傳播、性傳播和母嬰傳播。HBV是一種

8、雙鏈DNA病毒,屬于肝DNA病毒屬,能引起急性和慢性肝炎。HBV基因組由全長(zhǎng)為3.2kb的正鏈與一條不完全的負(fù)鏈組成不完全閉合的雙鏈環(huán)狀DNA,編碼四條重疊的mRNA分子,大小分別為3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb,然后在細(xì)胞質(zhì)中編碼七種病毒蛋白,分別是多聚酶(P)、S抗原、preS1、preS2、C抗原、preC、e抗原。其中3.5kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯形成多聚酶、核心蛋白(C)和前核心蛋白(preC),并作為前基因組的RN

9、A模板,反轉(zhuǎn)錄后作為病毒基因組復(fù)制的第一步。2.4kb和2.1kb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生大、中、小三個(gè)包裝蛋白,分別為preS1、preS2、S抗原。這三種蛋白具有一個(gè)共同的C端,只是在N端的氨基酸序列延長(zhǎng)的長(zhǎng)短不同。0.7kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生X蛋白,它具有轉(zhuǎn)錄激活的功能。
　　 HBV在感染、復(fù)制和增殖期間通過病毒蛋白與宿主蛋白相互作用不斷的適應(yīng)和調(diào)節(jié)宿主的環(huán)境,達(dá)到在宿主細(xì)胞生存的目的。通過研究病毒蛋白與宿主蛋白相互作用的數(shù)據(jù),我們可以

10、全面分析病毒的生命周期,同時(shí)有可能發(fā)現(xiàn)一些重要的相互作用,為將來的藥物治療提供一個(gè)新的靶標(biāo)。基于這個(gè)目的,我們利用TAP標(biāo)簽技術(shù)來研究HBV基因組蛋白與肝細(xì)胞HepG2蛋白的相互作用。首先,我們構(gòu)建了HBV基因組質(zhì)粒pCR-XL-TOPO-HBV,然后以此為模板,分別擴(kuò)增了P、S、preS1、preS2、C、preC和e基因。其次,我們構(gòu)建了在C端攜帶TAP標(biāo)簽和N端攜帶生物素標(biāo)簽的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBT-TAP-IRES-BIRA,并以

11、此載體作為對(duì)照載體。最后,我們把擴(kuò)增的七個(gè)基因分別插入到pBT-TAP-IRES-BIRA質(zhì)粒的SnaB I位點(diǎn),構(gòu)建了pBTIB-P、pBTIB-S、pBTIB-C、pBTIB-X、pBTIB-preC、pBTIB-preS1、pBTIB-preS2。為了減少標(biāo)簽蛋白對(duì)靶蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響,我們?cè)赟naB I位點(diǎn)兩邊加上了柔性氨基酸序列GSGGSG。
　　 我們通過把pBT-TAP-IRES-BIRA、pBTIB-X、pBT

12、IB-P、pBTIB-S、pBTIB-C、pBTIB-preC、pBTIB-preS1、pBTIB-preS2轉(zhuǎn)入PT67細(xì)胞包裝病毒來感染HepG2,用3.5μg/ml嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株,然后通過PT67細(xì)胞包裝病毒感染HepG2細(xì)胞,用50μg/ml的勻霉素和1μg/ml的嘌呤霉素篩選并獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。然后我們用TAP標(biāo)簽的抗體通過Westernblotting來鑒定目的蛋白的表達(dá)。最后,我們獲得了分別穩(wěn)定表達(dá)P、S、pr