異硫氰酸苯已酯對(duì)白血病細(xì)胞甲基化影響的研究.pdf

1、目的：CpG位點(diǎn)的異常甲基化是腫瘤早期而且是常見的基因改變。異硫氰酸苯已酯是一種組蛋白去乙?；敢种苿?擬研究異硫氰酸苯已酯對(duì)白血病細(xì)胞P16基因是否有去甲基化的作用。本試驗(yàn)采用甲基化特異性微陣列法定量檢測急性白血病P16基因的甲基化改變。初步探討異硫氰酸苯已酯在白血病細(xì)胞中去甲基化的作用。 方法：用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的序列中未甲基化的CpG位點(diǎn)被翻轉(zhuǎn)成TpG,而甲基化的CpG位點(diǎn)保持不變

2、。設(shè)計(jì)1組特殊熒光標(biāo)記探針構(gòu)建一種檢測P16基因啟動(dòng)子區(qū)3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化改變的芯片,探針包括一對(duì)非甲基化探針和甲基化探針,檢測相鄰的3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化的程度。本試驗(yàn)采用基因芯片的方法,將完全未甲基化的DNA和完全甲基化的DNA混合后制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,將待測細(xì)胞株DNA及病人樣本DNA點(diǎn)在芯片上與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較后得出定量檢測的結(jié)果。 結(jié)果：探針對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,R2=0.9660,呈很好的線性關(guān)系,可以用來消除背景“噪

3、音”,定量檢測樣本。用基因芯片成功的定量檢測了用OμM、5μM、10u M異硫氰酸苯已酯孵育U266細(xì)胞72小時(shí)后U266細(xì)胞株的甲基化程度,分別為78.2％,61.7％,54.8％。定量檢測了30例急性白血病樣本P16基因的甲基化改變。30例白血病患者中有11例(36.7％,11/30)出現(xiàn)了不同程度的P16基因高甲基化,在加入5μM異硫氰酸苯已酯孵育72小時(shí)后,有7例患者出現(xiàn)了不同程度的P16基因甲基化程度下降(-例由84.3％下降