質(zhì)膜蛋白3參與的真菌耐多烯類AmB機制研究.pdf

1、深部真菌感染是一種致病性真菌侵犯皮下組織和器官所引起的真菌感染性疾病，其死亡率較高且難以治療。兩性霉素B(Amphotericin B，AmB)是一種有效治療深部真菌感染的臨床用藥，但隨著AmB使用的增多，耐藥性問題日漸嚴峻，而且耐藥菌株的分子機制并不清楚。本實驗室前期研究表明質(zhì)膜蛋白3（PMP3p）高表達增加了細胞對AmB的抗性，但PMP3與AmB相關(guān)性的研究還很少。本文開展質(zhì)膜蛋白3在釀酒酵母(Saccharomyces cerev

2、isiae)和白色念珠菌（Canidia Albicans）中參與的耐AmB機制研究。
　　文獻研究表明AmB的作用機制主要有兩種：一種是通過與甾醇結(jié)合，使細胞質(zhì)膜形成孔洞，胞內(nèi)物質(zhì)外流，造成細胞死亡；一種是AmB能增加細胞內(nèi)的氧化損傷，造成細胞死亡。因此，首先，本文通過PI染色質(zhì)完整性檢測實驗和羅丹明123吸收和外排實驗，發(fā)現(xiàn)過表達PMP3能增加細胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性。因PMP3，最早是在植物中發(fā)現(xiàn)的，且對植物細胞內(nèi)離子的平衡有重要作

3、用。因此我們探究了在酵母中，PMP3調(diào)控兩性霉素B抗性與離子的關(guān)系。實驗表明PMP3對Na+的平衡起重要作用，而與K+和Ca2+沒有相關(guān)性。同時還發(fā)現(xiàn)，PMP3調(diào)節(jié)AmB的抗性與NHA1和VCX1通路是無關(guān)的。
　　其次，我們在甾醇合成通路阻斷的突變體（erg2△，erg6△，erg24△，hmg1△和hmg2△）中超表達PMP3基因也能夠提高細胞對AmB的抗性，說明阻斷甾醇合成通路并不影響PMP3調(diào)節(jié)細胞對AmB的抗性。進一步研

4、究在野生型（BY4741）及不同遺傳突變菌株中過表達PMP3甾醇含量沒有顯著變化。這表明PMP3不是通過調(diào)控甾醇的合成來影響細胞對AmB的抗性。
　　最后，研究了PMP3與藥物誘導(dǎo)的氧化脅迫之間的關(guān)系。結(jié)果表明AmB能造成細胞內(nèi)活性氧的增加，使細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（TBRAS）和蛋白羰基含量（CP）增加。并且抗氧化相關(guān)的酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)活性也增加，超表達PMP3能使

5、細胞內(nèi)抗氧化酶合成升高，降低了細胞內(nèi)的活性氧含量，從而保護了細胞，這表明超表達PMP3能提高細胞內(nèi)抗氧化酶降低胞內(nèi)活性氧來增加細胞對AmB的抗性。同時，已有研究表明細胞內(nèi)ROS的降低不僅與抗氧化酶有關(guān)，而且與MAPK通路有密切的關(guān)系。我們進一步研究表明，MAPK通路的中的關(guān)鍵基因SPC1和ATF1缺失的情況下（atf1△和spc1△），超表達PMP3不表現(xiàn)AmB抗性，也不能降低細胞內(nèi)活性氧；PT-PCR的檢測細胞PMP3表達水平與AmB