溶栓抗凝雙功能融合蛋白的構(gòu)建表達(dá)及在血栓疾病治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、心腦血管血栓性疾病是人類(lèi)的近年面臨的頭號(hào)殺手。溶栓和抗凝藥物組合應(yīng)用是臨床治療血栓疾病主要給藥方案，出血傾向是血栓治療的主要副作用。為提高葡激酶的選擇性、降低葡激酶的臨床用藥量，同時(shí)，降低水蛭素在非血栓部位的濃度或活性從而減小出血的危險(xiǎn)，我們利用水蛭素對(duì)凝血酶的高親和性和N—末端延伸引起活性降低的特性，首次設(shè)計(jì)并構(gòu)建了通過(guò)含有凝血因子FXa識(shí)別的六肽連接的葡激酶與水蛭素的融合蛋白，使之具有靶向溶栓抗凝雙功能和減小出血傾向等特性。

2、 融合蛋白在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，葡激酶因第28位天冬酰氨被糖基化而失去活化纖溶酶原活性。Val29突變?yōu)镻ro的突變體(V29P)基因構(gòu)建到pPIC9K載體并在甲醇利用型畢赤酵母中得到高效分泌表達(dá)，甲醇誘導(dǎo)96h，搖瓶發(fā)酵表達(dá)量達(dá)到1g/L，發(fā)酵上清液目的蛋白含量占總蛋白的70％以上，第28位天冬酰氨不發(fā)生糖基化；但表達(dá)產(chǎn)物不可逆地喪失葡激酶的活化纖溶酶原活性。研究還表明，葡激酶的Asn28、Thr30分別突變?yōu)镚ln、Ile的突變體均完

3、全喪失活性。計(jì)算分析表明，所突變的三個(gè)氨基酸使得葡激酶的β折疊結(jié)構(gòu)受到破壞，影響了葡激酶與纖溶酶原的結(jié)合，從而使之活性喪失，同時(shí)表明SAK的24至30位氨基酸殘基形成的β折疊結(jié)構(gòu)對(duì)維持其活性和功能是必需的。 將融合蛋白基因克隆到pBV220載體并在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。融合蛋白以可溶性蛋白的形式存在與大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中，采用反復(fù)凍融提取、離子交換和凝膠過(guò)濾方法純化了目的蛋白，純度達(dá)96％以上。①融合蛋白對(duì)凝血酶具有一定的靶向