溶栓抗凝雙功能融合蛋白的功能研究及質(zhì)量控制.pdf

1、凝血酶識別序列連接的重組葡激酶-水蛭素融合蛋白（STH）的高密度發(fā)酵、純化及功能研究
　　 目的：建立凝血酶識別序列連接的重組葡激酶-水蛭素融合蛋白（staphylokinaselinked with hirudin by thrombin recognition peptide，STH）的高密度發(fā)酵及其分離純化工藝，以獲得足量的蛋白，并對其體外和體內(nèi)功能進(jìn)行研究。
　　 方法：40L 發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后，離心收集菌體，

2、反復(fù)凍融后收集上清液，經(jīng)超濾、兩步陰離子交換層析，分離純化目的蛋白STH。以SDS-PAGE 電泳和反相高效液相色譜（RP-HPLC）鑒定純化獲得的STH的純度，瓊脂糖-纖維蛋白溶圈法檢測純化樣品STH的溶栓活性。SDS-PAGE和Western Blot 分析STH的裂解情況，發(fā)色底物法和纖維蛋白凝塊溶解法分析STH 及其裂解產(chǎn)物的抗凝活性，瓊脂糖-纖維蛋白溶圈法、發(fā)色底物法和纖維蛋白凝塊溶解法分析STH 及其裂解產(chǎn)物的溶栓活性，凝血

3、酶親和實(shí)驗(yàn)和纖維蛋白凝塊溶解法分析STH 對凝血酶的親和力，血栓彈力圖在體外分析STH 對血栓的溶栓與抗凝活性，大鼠下腔靜脈血栓模型和小鼠尾部橫切出血模型在體內(nèi)檢測STH的溶栓和抗凝活性及其出血副作用。
　　 結(jié)果：經(jīng)過20h 發(fā)酵后菌體干重達(dá)到32.20g/L，目的蛋白表達(dá)量可達(dá)1.48g/L。兩步陰離子交換層析純化后的STH的純度為98％以上，溶栓比活性2.6×104IU/mg，活性回收率56％，相對分子質(zhì)量2.3×104D

4、a。SDS-PAGE和Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STH 成功地被凝血酶識別并裂解，發(fā)色底物法分析結(jié)果表明STH 中HV2的N-末端成功地被SAK和連接肽封閉，從而封閉了其抗凝活性；當(dāng)STH 被凝血酶裂解后可以釋放出部分的抗凝活性，約為等摩爾HV2 35.68％的抗凝活性。發(fā)色底物法和血栓彈力圖結(jié)果顯示STH和SAK 具有相同的溶栓活性。凝血酶親和實(shí)驗(yàn)和纖維蛋白凝塊溶解實(shí)驗(yàn)分析顯示STH 中HV2的C-末端仍然保持了對凝血酶的

5、高親和力，從而使STH具有了對血栓的靶向性。纖維蛋白凝塊溶解法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STH 能夠被凝塊中的凝血酶裂解并釋放出抗凝活性，從而發(fā)揮溶栓和抗凝雙重功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STH 在表現(xiàn)出更高的溶解血栓能力的同時還表現(xiàn)出較低的出血副作用。
　　 結(jié)論：建立了STH的生產(chǎn)工藝，該工藝簡便，時程短，重復(fù)性好，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。從體外和體內(nèi)兩個方面考察了STH的功能，結(jié)果顯示STH 在表現(xiàn)出溶栓和抗凝雙功能的同時還表現(xiàn)出對血栓具有一定的

6、靶向性，而顯示出較低的出血副作用。
　　 Fxa 識別序列連接的重組葡激酶-水蛭素融合蛋白（SFH）原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究
　　 目的：建立Fxa 識別序列連接的重組葡激酶-水蛭素融合蛋白（staphylokinase linkedwith hirudin by Fxa recognition peptide，SFH）原液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
　　 方法：參考《中華人民共和國藥典》2005年版（三部）和生物制品相關(guān)指導(dǎo)原則

7、，對SFH 原液進(jìn)行了以下項(xiàng)目的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究：采用Lowry 法進(jìn)行蛋白含量測定，非還原性SDS-PAGE 電泳和RP-HPLC 進(jìn)行純度測定，溶菌圈法進(jìn)行抗生素殘留測定，發(fā)色底物法進(jìn)行抗凝活性檢測。
　　 結(jié)果：三批SFH 原液的蛋白含量經(jīng)Lowry 法檢測結(jié)果分別是：18.48、24.85和23.96mg/ml，均符合擬定的大于15mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)；SDS-PAGE電泳法檢測三批SFH 原液純度結(jié)果分別為96％、97％和97

8、％，均符合擬定的大于95％的標(biāo)準(zhǔn)；RP-HPLC 法檢測三批SFH 原液純度結(jié)果分別為99.32％、100％和100％，均符合擬定的大于95％的標(biāo)準(zhǔn)；溶菌圈法檢測三批SFH 原液的抗生素殘留均為陰性；發(fā)色底物法檢測三批SFH 原液裂解0h的抗凝活性分別為3.32％、-7.63％和3.77％，符合擬定的±10％的范圍；發(fā)色底物法檢測三批SFH 原液裂解3h的抗凝活性分別為72.24％、60.72％和65.08％，符合擬定的大于50％的標(biāo)準(zhǔn)