一支箭凝集素（Ophioglossum Pedunculosum Desv Agglutinin）的分離純化及性質研究.pdf

1、一支箭根部經勻漿、浸取、硫酸銨分級沉淀、陰離子交換柱(DEAE-Sepharosc)和Sephacryl S-100分子篩層析得到經過SDS-PAGE檢測為單一條帶的一支箭凝集素(Ophioglossum pedunculosum Desv Agglutinin，OPA)純品。其表觀分子量為19.1kDa，亞基分子量為19.1kDa，表明OPA.是分子量約為19.1kDa的單體蛋白。凝血活性結果表明，OPA能凝集天然兔血細胞，其凝集兔血

2、細胞效價為1.95μg/ml。 OPA還能凝集人O型血細胞，但對人A、B型血均不凝集。糖抑制實驗表明，甲狀腺球蛋白及甘露聚糖能夠強烈抑制其活性。 研究了不同溫度、pH和變性劑對OPA凝血活性和熒光光譜的變化，凝血活性在40℃以下保持相對的穩(wěn)定性，高于50℃，凝血活性逐步喪失，當溫度達90℃時，OPA活性大部分喪失，100℃仍有20％的活性；pH為4-9時OPA活性相當穩(wěn)定，最適pH為8；當pH為11時，大部分凝血活性丟失，而pH

3、為2時仍保留50％的活性。表明OPA對高溫，對酸性環(huán)境表現出較強的耐受性。 295nm激發(fā)時，天然OPA的最大熒光發(fā)射峰在328nm處，比游離Trp的最大熒光發(fā)射峰348nm藍移了20nm，說明Trp周圍的極性較弱，位于相對疏水區(qū)，并未完全暴露于周圍溶劑中。280nm激發(fā)時，其最大熒光發(fā)射峰在340rim處，熒光強度增加，說明OPA的內源熒光發(fā)生了從Tyr到Trp的能量轉移。 研究了氯化銫，碘化鉀，丙烯酰胺和琥珀酰亞胺對

4、OPA的熒光粹滅作用，丙烯酰胺和琥珀酰亞胺對OPA中Trp淬滅程度達100％，KI淬滅約62.5％的Trp熒光，而氯化銫基本不能淬滅OPA的熒光，表明幾乎所有的色氨酸位于凝集素近分子表面相對疏水的淺溝或強陽離子區(qū)域。 用熒光光譜法研究了變性劑脲，鹽酸胍和SDS在不同濃度下對OPA構象，發(fā)現當濃度逐漸增加時，熒光強度急劇增強。脲、鹽酸胍、SDS對凝集素凝血活性的影響表明，脲對OPA的活性沒有太大的影響。而隨著變性劑鹽酸胍、SDS濃

5、度的升高，凝血活性逐漸喪失。 NBS修飾Trp過程中，熒光強度明顯降低，最大發(fā)射波長開始沒有明顯變化，隨著Trp不斷被修飾，發(fā)射峰明顯藍移。計算表明大約有1個色氨酸殘基位于OPA分子表面，對凝血活性有一定的影響。用2，3-butanedione修飾精氨酸結果表明，對其修飾后導致凝血活性喪失70％，精氨酸修飾在'維持凝血活性中心或分子構象中起著一定的作用。用DEPC修飾組氨酸以及用NBSF修飾酪氨酸，修飾后OPA凝血活性均沒有變化