刺參（Apostichopus japonicus）感染兩種病原菌前后體內(nèi)凝集素的分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、凝集素(lectin)是一類具有糖專一性，可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白，其研究歷史已有一百多年。凝集素可與生物體內(nèi)大量功能各異的糖復(fù)合物結(jié)合，形成一系列生物學(xué)功能。在動(dòng)物和植物體內(nèi)，凝集素又有一些不同的功能。凝集素的獨(dú)特的生物學(xué)功能為其應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊的前景。早期對(duì)凝集素的研究多集中于高等植物。2001年，Yeaton在103種無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了凝集素的存在，并推斷在所有無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)可能都有凝集素。凝集素除了存在于甲殼動(dòng)物、軟體動(dòng)物

2、等無(wú)脊椎動(dòng)物的血清中，也常常吸附在血細(xì)胞的細(xì)胞膜上。 刺參(Apostichopus japonicus)屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirota)刺參科(Stichopodidae)仿刺參屬(Apostichopus)。刺參為溫帶種，在我國(guó)主要分布于遼寧、河北、山東和江蘇等沿海省份。刺參營(yíng)養(yǎng)豐富，體壁含有豐富的膠原成分和蛋白聚糖，還含有大量的黏蛋白及多種

3、氨基酸。最近有研究證明刺參含有防衰老的酸性粘多糖(硫酸軟骨素)，具有較廣的抗腫瘤及抗凝血的作用，并具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，是一種藥用價(jià)值極高的海洋生物。 刺參作為一種無(wú)脊椎動(dòng)物，一般認(rèn)為缺少適應(yīng)性免疫，其“非己”識(shí)別免疫功能存在于某些特性的、可溶的或與細(xì)胞膜結(jié)合的模式識(shí)別受體(pattem recognition receptors，PRRs)，也成為模式識(shí)別蛋白(pattern recognition proteins，P

4、RPs)或模式識(shí)別分子(pattern recognition molecules，PRMs)，這種模式識(shí)別受體就包含凝集素。因此，凝集素在刺參體內(nèi)起著重要的免疫功能。當(dāng)刺參受到病原及其它外界條件影響時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此其體內(nèi)凝集素的量必將與正常狀況下有所不同。 20世紀(jì)80年以來(lái)，我國(guó)的海水養(yǎng)殖業(yè)逐漸振興并發(fā)展迅速，魚類、海珍品類的增養(yǎng)殖進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期。刺參人工育苗，年產(chǎn)量猛增數(shù)千萬(wàn)頭，刺參增養(yǎng)殖在山東、遼寧等地初具規(guī)

5、模。隨著國(guó)內(nèi)刺參養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖面積的迅速擴(kuò)張以及集約化養(yǎng)殖方式下的不規(guī)范操作，養(yǎng)殖過(guò)程中相繼出現(xiàn)一系列病害問(wèn)題，給刺參養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。 刺參“爛皮病”因其高傳染性、高死亡率成為刺參養(yǎng)殖病害研究的重點(diǎn)。其發(fā)病特征一般為：感染初期刺參口部先出現(xiàn)感染癥狀，表現(xiàn)為圍口膜松弛，觸手對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，繼而出現(xiàn)排臟現(xiàn)象；感染中期刺參身體收縮、僵直，口腹部出現(xiàn)小面積潰瘍，形成藍(lán)白色小斑點(diǎn)，逐漸喪失攝食能力；感染末期刺參的病灶變

6、大，潰瘍處增多，表皮腐爛面積變大，最后導(dǎo)致刺參死亡，溶化成鼻涕狀膠體。 本文利用本實(shí)驗(yàn)室已分離出的兩種刺參爛皮病病原菌(Tenacibaculum屬和Vibrionales屬)對(duì)健康個(gè)體進(jìn)行感染，分別分離純化其凝集素，利用動(dòng)物的紅細(xì)胞對(duì)對(duì)其凝集素的凝集活性分別進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行分子量、含糖量、最適pH、耐熱性等性質(zhì)的研究，以期為刺參的免疫機(jī)制研究及藥用研究提供科學(xué)的數(shù)據(jù)參考。 研究方法及結(jié)果為：刺參經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液抽提，2

7、0％～75％硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100柱層析，得到刺參凝集素(AJL)。經(jīng)SDS-PAGE顯示單一條帶，亞基相對(duì)其分子量為31000。分別提取感染Tenacibaculum屬和Vibrionales屬病原菌的刺參凝集素，感染Tenacibaculum屬病菌刺參的凝集素產(chǎn)量較大，但凝集兔紅細(xì)胞的作用均不被D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、