陰道毛滴蟲(chóng)沉寂信息調(diào)節(jié)因子Sir2和Sir2-like及半乳糖苷酶β-Gal基因克隆、表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位.pdf

1、研究目的:(1)克隆原生動(dòng)物陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonas vaginalis)沉寂信息調(diào)節(jié)因子2(Silent information regulator2, SIR2)同源基因:TvSIR2。構(gòu)建TvSIR2和TvSIR2-like(我室克隆)基因原核表達(dá)重組載體并表達(dá)其融合蛋白,制備抗體, Western blotting鑒定后免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞定位。
　　(2)克隆陰道毛滴蟲(chóng)β-半乳糖苷酶(β-galactosidas

2、e,β-GAL)同源基因:Tvβ-GAL。構(gòu)建Tvβ-GAL原核表達(dá)載體并表達(dá)融合蛋白。
　　材料和方法:(1)從陰道毛滴蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)中克隆出SIR2的同源基因并進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域同源性分析。將部分TvSIR2和TvSIR2-like cDNA片段克隆入表達(dá)載體pET-41,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D–galactoside,IPTG)誘導(dǎo)下表達(dá)目的基因融合蛋白, N

3、i-NTA親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物,SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量和純化的表達(dá)產(chǎn)物。用純化的融合蛋白免疫豚鼠,獲得抗血清,Western blotting對(duì)抗體特異性分析鑒定后用免疫熒光法進(jìn)行陰道毛滴蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)定位。
　　(2)從陰道毛滴蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)中克隆出β-GAL的同源基因并進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域同源性分析。將部分cDNA片段克隆入表達(dá)載體pQE-80L,轉(zhuǎn)化大腸桿菌SG13009,在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的基因融合蛋白。

4、　　結(jié)果:(1)從陰道毛滴蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)中成功分離到沉寂信息調(diào)節(jié)因子SIR2同源基因TvSIR2。克隆到的TvSIR2 cDNA長(zhǎng)1034對(duì)堿基,包括開(kāi)放閱讀框架915對(duì)堿基,推測(cè)編碼蛋白序列含有304個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為5.5。序列分析表明它與Sir2p及其同源蛋白有較高的同源性,其中與家蠶(Bombyx mori)的Sir2p同源性最高,在307個(gè)氨基酸的保守序列區(qū),一致性和相似性達(dá)到47％和64%。其次是人,在301個(gè)氨基酸中一

5、致性和相似性分別為43%和60%。與酵母的Sir2p相比,在241個(gè)保守氨基酸序列中一致性和相似性分別為41%和55%。與線蟲(chóng)在240個(gè)氨基酸保守序列中一致性和相似形分別為39%和61%。與果蠅的的Sir2p蛋白質(zhì)一致性和相似性在256個(gè)氨基酸中分別為38%和54%。與我室分離到的另一個(gè) TvSir2-like蛋白一致性和相似性在277個(gè)氨基酸中分別為29%和50%。它具有Sir2p及其同源蛋白的三個(gè)特征性保守結(jié)構(gòu)域;生物軟件GOR I

6、V分析TvSir2p富含α螺旋,與古細(xì)菌(archaeal)的SIR2二級(jí)結(jié)構(gòu)較為相符。PSORT II軟件預(yù)測(cè)TvSir2p有69.6%的可能存在于細(xì)胞漿中。故此推斷TvSIR2系酵母SIR2的同源基因。成功構(gòu)建pET-41a/TvSIR2和pET-41a/TvSIR2-like表達(dá)載體,分別用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)谷光苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析與

7、預(yù)期的分子量一致。用它們的融合蛋白免疫豚鼠得到的抗體分別可以與各自的融合蛋白和滴蟲(chóng)總蛋白反應(yīng)。使用得到的抗體用免疫熒光法在滴蟲(chóng)細(xì)胞檢測(cè)到 TvSir2和TvSir2-like蛋白位于細(xì)胞核外的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體區(qū)域。
　　(2)從陰道毛滴蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)中成功分離到β-半乳糖苷酶同源基因:Tvβ-GAL?？寺〉降腸DNA長(zhǎng)2445個(gè)對(duì)堿基,包括開(kāi)放閱讀框架2415對(duì)堿基,推測(cè)編碼蛋白序列含有804個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為5.4

8、。序列分析顯示,Tvβ-Galp與多種來(lái)源的β-Gal同源蛋白均具有較高同源性。其中與多型擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的β-Galp同源性最高,在793個(gè)氨基酸的保守序列區(qū),一致性和相似性達(dá)到58%和74%。其次是黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)的β-Galp,在786個(gè)氨基酸中一致性和相似性分別為50%和66%。與熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的β-G

9、alp在730個(gè)氨基酸中一致性和相似性分別為40%和56%。與野油菜黃單包菌(Xanthomonas campestris)的β-Galp在812個(gè)氨基酸中一致性和相似性分別為37%和52%。生物軟件GOR IV分析Tvβ-Galp富含線狀延伸(31.09% Extended strand)結(jié)構(gòu)。PSORT II軟件預(yù)測(cè)Tvβ-Galp有66.7%的可能存在于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)。用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá) Tvβ-GAL/GST融合蛋白,并

10、經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析與預(yù)期的分子量一致。
　　結(jié)論:(1)成功克隆陰道毛滴蟲(chóng)沉寂信息調(diào)節(jié)因子2基因的同源基因TvSIR2。并分別獲得抗TvSIR2/GST和TvSIR2-like/GST融合蛋白的抗血清,免疫熒光法檢測(cè)他們均定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體,為研究TvSIR2和TvSIR2-like在模式生物陰道毛滴蟲(chóng)功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)成功克隆陰道毛滴蟲(chóng)β-半乳糖苷酶同源基因 Tvβ-GAL,得到 T