視網膜小膠質細胞在細菌脂多糖誘導的感染性眼內炎中的致病作用.pdf

1、細菌性眼內炎是眼外傷或內眼手術后常見的致盲性并發(fā)癥，而視網膜的結構和功能的損害是致盲的主要原因。在感染性眼內炎，感染引起的視網膜炎癥可導致血視網膜屏障的破壞、視網膜內大量外周血來源的炎癥細胞浸潤和視網膜解剖學結構破壞，如感光細胞層皺褶和脫離、或視網膜各細胞層完全溶解崩潰，最終視網膜功能喪失。在感染性眼內炎，導致視網膜功能和結構的破壞的視網膜炎癥反應的確切免疫機制目前并不清楚，因而，臨床上可有效地抑制視網膜炎癥和給視網膜提供神經保護作用的

2、治療措施相當缺乏。
　　 小膠質細胞是中樞神經系統(CNS)的一種固有的組織型巨噬細胞。最近的研究表明在CNS神經退行性疾病和感染性疾病如腦膿腫、多種病毒和原蟲性感染等病理情況下，小膠質細胞被激活并在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵性作用，小膠質細胞的激活可導致神經損害。米諾環(huán)素(MC)，一種半合成的第二代四環(huán)素衍生物，無論是在感染性或非感染性CNS疾病，均可有效抑制小膠質細胞的活性并對神經細胞有保護作用，展示出一種有益的免疫調控潛能。

3、然而，視網膜小膠質細胞在感染性眼內炎中的致病作用和米諾環(huán)素能否在眼內細菌性感染引起的宿主免疫炎癥性反應的發(fā)揮調控作用，目前尚未見相關研究。對感染性眼內炎的宿主和致病菌之間的相互作用的分子和細胞學的機制的進行充分的研究，可為發(fā)展新的眼內炎治療策略提供新的靶向。本研究目標是設計出一種可精確區(qū)分視網膜內被激活的視網膜小膠質細胞和外周血來源的浸潤炎癥細胞的方法，并探討視網膜小膠質細胞在內毒素誘導的眼內炎中的致病作用；最后，我們對米諾環(huán)素在細菌脂

4、多糖誘導的感染性眼內炎的治療作用進行觀察。
　　 第一部分在體標記視網膜小膠質細胞
　　 目的:對視神經橫斷后的SD大鼠的視網膜小膠質細胞的形態(tài)、分布和細胞密度進行觀察。
　　 方法:將4-Di-10-ASP染料顆粒填充于視神經鞘內視神經橫斷面以逆行標記視網膜小膠質細胞。分別在視神經橫斷后14，28，35，42和56天處死大鼠摘除眼球，視網膜以0X42和TNF-α行免疫組織化學染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、>　　 結果:在視神經橫斷后14天可發(fā)現散在的4Di-10ASP標記的節(jié)細胞。至28天節(jié)細胞則幾乎完全消失，OX-42和4Di-10ASP均呈陽性的小膠質細胞，主要分布于內叢狀層(IPL)，節(jié)細胞層(GCL)，神經纖維層(NFL)，也可見少量小膠質細胞位于外叢狀層(OPL)。小膠質細胞形態(tài)上以呈現樹枝狀突起為主，胞體直徑較小。所有4Di-10ASP(+)細胞0X42均呈陽性；在視神經橫斷后28，35，42和56天，視網膜小膠質細胞計數

6、分別為350.8±14.21；360.2±21.47；336±9.91和341±12.65 cells/mm2,各組間差異無統計學意義。在視神經橫斷后28-56天內，視網膜內未見TNF-Q陽性細胞。
　　 結論:熒光染料4Di-10ASP可特異性逆行標記全部視網膜小膠質細胞。在視神經橫斷后28至56天，這些細胞均處于穩(wěn)定的靜止狀態(tài)。因此，本動物模型可作為動態(tài)跟蹤觀察視網膜小膠質細胞活性和細胞動力學變化的理想平臺。
　　

7、第二部分視網膜小膠質細胞在LPS誘導的眼內炎中的致病作用
　　 目的:觀察LPS眼內注射后視網膜小膠質細胞的細胞動力學變化，并探討其在LPS誘導的感染性眼內炎中的致病作用。
　　 方法:將SD大鼠以4-Di-10-ASP染料顆粒填充于視神經橫斷面逆行標記視網膜小膠質細胞。在視神經橫斷后28天，向玻璃體腔內注入LPS以建立感染性眼內炎動物模型。在LPS注射后不同時點處死大鼠摘除眼球，視網膜以OX42、IL-1β、TNF-α

8、行免疫組織化學染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 結果:LPS玻璃體腔內注入后3小時，視網膜小膠質細胞主要位于GCL和IPL，此部位的視網膜小膠質細胞的數量較NS對照組(350±11cell/mm2)有較明顯的增加(分別為3小時后458±45.6 Cell/mm2和6小時后477±87 Cell/mm2,兩組均P<0.05)，而冰凍切片則顯示視網膜小膠質細胞主要位于NFL和IPL，在OPL，幾乎檢測不到視網膜小膠質細胞。視網

9、膜小膠質細胞呈多種形態(tài)，由雙極狀或多分支狀變?yōu)榘w變大，呈阿米巴樣外觀，突起變短。此時視網膜小膠質細胞已表達TNF-α和IL-1β。LPS玻璃體腔內注入后3小時，在視網膜小血管內僅可見圓形白細胞(OX42(+)/4-Di-10ASP(-)細胞)開始貼壁并粘附于血管內壁。至LPS玻璃體腔內注入后6小時后，大量炎癥細胞已浸潤至視網膜內。
　　 結論:在LPS誘導的感染性眼內炎的早期，視網膜小膠質細胞被激活，向視網膜內層遷移，由雙極、

10、多分支狀的狹長形態(tài)變?yōu)榇蟀w、分支粗短的阿米巴樣外觀，并表達促炎因子TNFα和IL-1β；這些小膠質細胞的遷移和活化發(fā)生在外周炎癥細胞浸潤入視網膜之前，這提示在LPS誘導的感染性眼內炎，視網膜小膠質細胞可能起啟動眼內炎癥，招募血液中的炎癥細胞導致炎癥的擴大的關鍵作用。
　　 第三部分米諾環(huán)素對LPS誘導的感染性眼內炎的治療作用
　　 目的:探討米諾環(huán)素在LPS誘導的感染性眼內炎的治療作用。
　　 方法:首先建立L

11、PS誘導的SD大鼠眼內炎動物模型。在LPS注射前12小時及其后連續(xù)7天每天向上SD大鼠腹腔內注射米諾環(huán)素(50mg/Kg溶于0.2ml生理鹽水)。在LPS注入后的不同時點，對眼部炎癥分別進行臨床和組織病理學檢查，并測定前房水蛋白質濃度。
　　 結果:在LPS注射后3小時，兩組大鼠均在前房出現閃輝和細胞纖維素性滲出。在L，PS眼內注入后12至24小時，兩組大鼠LPS誘導的眼內炎癥反應均達到高峰，在第3天后迅速減輕。在LPS注射后所

12、有時點，在米諾環(huán)素治療組大鼠可以觀察到明顯的臨床炎癥減輕和前房纖維素性滲出減少。炎癥細胞計數顯示，與對照組比較，米諾環(huán)素治療組浸潤至玻璃體腔內的炎癥細胞明顯減少(在LPS注射后24小時分別為356±55和1125±65.6)。米諾環(huán)素治療組在各時點可觀察到前房蛋白濃度輕度下降，但種差異無統計學意義。
　　 結論:米諾環(huán)素可明顯抑制白細胞的眼內浸潤并有效減輕LPS誘導的感染性眼內炎炎癥反應，但不能改善血眼屏障的破壞。這些結果進一步