弓形蟲次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HXGPRT）和腺苷激酶（AK）基因的克隆、表達(dá)及多抗血清的制備.pdf

1、目的：克隆弓形蟲RH株次黃嘌呤-黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HXGPRT)和腺苷激酶(AK)基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a/HXGPRT和pET28a/AK，表達(dá)HXGPRT和AK重組蛋白，利用此重組蛋白免疫新西蘭白兔制備多抗血清。 方法：復(fù)蘇本室液氮保種的弓形蟲RH株速殖子，腹腔接種BALB/c小鼠，轉(zhuǎn)種3代，抽取腹水，收集、純化弓形蟲株速殖子，提取總RNA，在設(shè)計合成的引物中引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。應(yīng)用RT-

2、PCR擴(kuò)增弓形蟲HXGPRT，AK基因片段，目的基因HXGPRT插入克隆載體pMD18-T，目的基因AK插入克隆載體pGEM-T，提取重組質(zhì)粒，BamHI和XhoI雙酶切獲得目的基因，插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a中，重組子雙酶切、PCR和測序鑒定，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli BL21(DE3)并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。親和層析法純化重組蛋白抗原，SDS-PAGE和Western blotting驗證表達(dá)量和免疫活性，改良的Bradford(考

3、馬斯亮藍(lán))法測定純化rHXGPRT和rAK蛋白濃度。免疫新西蘭白，收集多抗血清，ELISA測定多抗滴度，Western blotting鑒定免疫活性。 結(jié)果：RT-PCR從弓形蟲RH株RNA中擴(kuò)增出693bp的HXGPRT和1092bp的AK目標(biāo)基因片段。成功地將其克隆入pET28a。pET28a/HXGPRT和pET28a/AK經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，獲得與目標(biāo)基因大小相一致的基因片段，測序結(jié)果與GenBank比對HXG

4、PRT同源性100％，AK同源性99.9％。含pET28a/HXGPRT和pET28a/AK的宿主菌E．coliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)上述2個重組蛋白，經(jīng)Ni<'2+>親和層析法純化獲得了高純度的rHXGPRT和rAK蛋白。SDS-PAGE檢測其分子量：rHXGPRT為26.4kDa，rAK為38.357kDa，二者與各自預(yù)期分子量大小相符。Western blotting顯示：rHXGPRT能夠被弓形蟲患者血清中的

5、IgG抗體和Torch-ELISA試劑合中的Tox-IgG陽性控制血清識別，rAK能夠被Torch試劑合中的Tox-IgG陽性控制血清識別，獲得了兩種純化的具有特異免疫反應(yīng)性的重組蛋白。rHXGPRT和rAK分別免疫新西蘭白兔，獲得ELISA滴度為1∶10<'7>和1∶10<'6>兩種多價抗血清，Westernblotting顯示，每種多價血清不僅能和其對應(yīng)的重組蛋白而且和蟲體內(nèi)相應(yīng)蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。 結(jié)論：成功地從弓形蟲