HMGB1表達(dá)水平與COPD大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞合成分泌的關(guān)系.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種重要的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)多，病死率高，已成為全球第四大致死疾病，而我國COPD總患者數(shù)高達(dá)4300萬人，平均每分鐘就有2.5人死于COPD。由于其緩慢進(jìn)行性發(fā)展，嚴(yán)重影響患者的勞動能力和生活質(zhì)量，人們對該病的重視程度已越來越高。COPD患者在急性發(fā)作期過后，臨床癥狀雖有所緩解，但其肺功能仍在繼續(xù)惡化，并且由于自身防御和免疫功能的降低以及外界各種有害因素的影響，經(jīng)常反復(fù)發(fā)作，容易繼發(fā)肺動脈高壓，而

2、逐漸產(chǎn)生各種心肺并發(fā)癥。COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與個人吸煙、環(huán)境破壞、空氣污染、小氣道感染、塵肺等關(guān)系密切，尤其PM2.5濃度與COPD息息相關(guān)。一項為期6個月的縱向研究表明，室內(nèi)PM2.5和NO2的濃度升高與COPD患者夜間癥狀加重和急性發(fā)作增加有關(guān)。因此，預(yù)防COPD的主要措施是避免發(fā)病的高危因素、急性加重的誘發(fā)因素以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力。戒煙是預(yù)防COPD的簡單易行且有效措施?？刂坡殬I(yè)和環(huán)境污染，減少有害氣體或有害顆粒的吸人，可減輕氣道

3、和肺的異常炎癥反應(yīng);另有研究報道，如果早期發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)，且有利于防治COPD。
　　研究證實，COPD是一種慢性全身性炎癥反應(yīng)性疾病。多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)如高遷移率族蛋白1（HMGB1）、干擾素γ(IFN-γ)、白介素6（IL-6）等參與炎癥反應(yīng)過程。高遷移率族蛋白系于上世紀(jì)60年代最早發(fā)現(xiàn)，一種含量豐富的高度保守的非組蛋白核蛋白，廣泛分布于哺乳動物細(xì)胞，具有晚期促炎作用，因其在凝膠電泳中泳動速度快而得名。高遷移率族蛋白存在于

4、多種細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，通過HMGBbox與DNA結(jié)合。高遷移率族蛋白包含HMGB1、HMGB2、HMGB3三個相關(guān)成員，且85％有同源性，同時HMGB1是在各種因素作用下以主動分泌和被動釋放兩種方式到達(dá)細(xì)胞核外。HMGB1是新近發(fā)現(xiàn)的晚期炎癥細(xì)胞因子，具有免疫刺激特性，在COPD等疾病發(fā)病過程中具有重要作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1升高與血清中TNF—a、IL—p/IL—6等炎性細(xì)胞因子的水平上調(diào)有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞壞死或受損時，

5、在TNF的作用下核內(nèi)的HMGB1可釋放到胞外，引發(fā)單核巨噬細(xì)胞分泌促炎因子;而促炎因子又可進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的分泌，形成正反饋環(huán)，或者說網(wǎng)絡(luò)式級聯(lián)放大“瀑布”效應(yīng)。在炎性反應(yīng)的后期，這種正反饋效應(yīng)對炎性反應(yīng)的維持具有重要的作用。1973年Younger和Salvin最先發(fā)現(xiàn)γ干擾素，其來自淋巴細(xì)胞。其生物學(xué)功能主要是免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)多種抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ/Ⅱ分子，活化單核、巨噬細(xì)胞，分泌IL-1、6、8及TNF-a等。IFN-γ

6、還能活化中性粒細(xì)胞等，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)育和抑制TH2細(xì)胞活化與增殖。IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生，促進(jìn)NO的合成，IFN-γ可增加LPS誘導(dǎo)的IL-1轉(zhuǎn)錄翻譯和分泌。IL-6是TH2細(xì)胞因子的典型代表，主要由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長與分化，如調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)及造血功能，并在抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。IL-6在COPD等多種疾病時有明顯改變;IL

7、-6表達(dá)失調(diào)可引起許多疾病，其臨床表現(xiàn)主要為發(fā)病時IL-6水平增高。研究顯示，IL-6上升的水平與疾病的活動期以及治療效果都密切相關(guān)，因此，對病人體液中IL-6水平的檢測可反映患者的病情變化。
　　COPD的全身炎癥反應(yīng)與肺血管重塑、肺動脈高壓密切相關(guān)。研究表明，PASMCs不僅是肺血管重塑的主要效應(yīng)細(xì)胞，而且可作為免疫細(xì)胞合成分泌相關(guān)細(xì)胞因子參與炎癥發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)肺血管重塑。作為主要前炎癥細(xì)胞因子的HMGB1與COPD患者PA

8、SMCs的合成分泌功能之間是否存在調(diào)控關(guān)系未見相關(guān)報道。本實驗以COPD模型大鼠原代培養(yǎng)的PASMCs為研究對象，采用分子生物學(xué)技術(shù)，從細(xì)胞水平內(nèi)探討HMGB1表達(dá)水平與PASMCs合成釋放IFN-γ、IL-6等炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性，以期進(jìn)一步探討COPD肺血管重塑、肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制，并為進(jìn)一步預(yù)治COPD提供實驗依據(jù)和干預(yù)靶標(biāo)。
　　第一部分:大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及其生物學(xué)特性和功能的研究
　　目的:研究采

9、用組織塊貼壁法體外培養(yǎng)原代大鼠遠(yuǎn)端PASMCs，探討COPD模型大鼠與正常大鼠遠(yuǎn)端PASMCs的生物學(xué)特性及功能的異同。
　　方法:SPF級SD雄性大鼠12只，分2組:(1)對照組:第1、14天經(jīng)氣道內(nèi)注入同等劑量生理鹽水，無香煙煙霧暴露，與模型組同等條件下正常飼養(yǎng)。(2)COPD大鼠模型組:于實驗第1、14天經(jīng)氣道內(nèi)注入脂多糖(LPS)溶液，200μg/次，香煙煙霧暴露1h/d，共8周。模型建立后，組織塊貼壁法提取并原代培養(yǎng)各組

10、大鼠遠(yuǎn)端PASMCs。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長特點;細(xì)胞免疫組化、透射電鏡鑒定PASMCs;CCK8和細(xì)胞熒光流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:倒置相差顯微鏡下PASMCs為長梭形或“魚尾”狀，為典型的“峰-谷”樣生長，兩組細(xì)胞形態(tài)及生長特點無明顯差異;細(xì)胞免疫組化、透射電鏡鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞98％以上為PASMCs;CCK8檢測結(jié)果示:COPD模型組PASMCs吸光度（A值）高于生理鹽水對照組(P＜0.05);

11、采用CFDASE通過流式細(xì)胞儀檢測示:COPD模型組PASMCs增殖強(qiáng)于生理鹽水對照組(P＜0.05)，即生理鹽水對照組PASMCs熒光會增強(qiáng)。
　　結(jié)論:正常組與COPD模型組原代培養(yǎng)的PASMCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)相似，但生物學(xué)特性不同，功能亦存在差異。
　　第二部分:HMGB1表達(dá)水平與COPD大鼠PASMCs合成分泌IFN-γ、IL-6的關(guān)系
　　目的:探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞(PA

12、SMCs)高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá)水平與其合成分泌干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6的相關(guān)性及臨床意義。
　　方法:建立COPD大鼠模型，原代培養(yǎng)PASMCs并鑒定，檢測香煙煙霧提取物(CSE)及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)下PASMCs合成分泌細(xì)胞因子的功能，實驗分組:A組（對照組，加入含25％胎牛血清DMEM培養(yǎng)）、B組(另加入5％CSE0.5ml)、C組(另加入100ng/mlLPS0.1ml)、D組(另加入5％CSE0

13、.5ml+100ng/mlLPS0.1ml)，同時A、B、C、D四組另瓶培養(yǎng)，并分別加入1∶1000抗HMGB1抗體0.2ml培養(yǎng)設(shè)立抗HMGB1抗體干預(yù)組(A1、B1、C1、D1);分別于培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后，采用Western blot檢測各組PASMCs中HMGB1蛋白表達(dá)變化，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液HMGB1、IFN-γ濃度，并進(jìn)行相關(guān)分析。
　　結(jié)果:(1)光鏡下見細(xì)胞呈長梭形或“峰、谷”狀生長，α

14、—actin免疫組化染色及細(xì)胞免疫熒光鑒定為PASMCs;(2)Western blot及ELISA法檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)12h后B、C、D實驗組中HMGB1表達(dá)水平及細(xì)胞上清液HMGB1、IFN-γ、IL-6濃度較A組強(qiáng)(P＜0.05)，且B、C、D三組呈依次遞增(P＜0.05);HMGB1蛋白表達(dá)水平與IFN-γ、IL-6濃度變化呈正相關(guān)(r=0.91、0.83);加入抗HMGB1抗體干預(yù)培養(yǎng)12h后，干預(yù)組與對應(yīng)實驗組相比HMGB1

15、、IFN-γ、IL-6都減弱(P＜0.05);同組內(nèi)，于細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h、72h，Westernblot及ELISA法檢測結(jié)果均無明顯差異(P＞0.05）。
　　結(jié)論:1.COPD模型大鼠遠(yuǎn)端PASMCs合成分泌HMGB1較生理鹽水對照組增加;2.HMGB1表達(dá)水平與IFN-γ、IL-6成正相關(guān)，抗HMGB1抗體可通過抑制HMGB1，下調(diào)IFN-γ、IL-6的表達(dá)，提示HMGB1可能成為臨床上防治COPD炎癥的干預(yù)靶