人肝癌HepG2細(xì)胞α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅳ基因靶向miRNA干擾載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、背景：
　　 肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)死亡率在全球癌癥死亡率中居第三位，在我國為第二位癌癥死因。采取以手術(shù)治療為主的綜合治療方式，雖有效提高了術(shù)后生存率，但即使根治性切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率1年達(dá)20％-64％；3年高達(dá)57％-81％，而局部治療的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率更高。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步提高肝癌生存率的一個瓶頸。肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有三個途徑，首先是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，第二是肝外轉(zhuǎn)移，第三為種植轉(zhuǎn)移。通過對肝癌

2、早期轉(zhuǎn)移機制研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞多通過門靜脈發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，肝癌細(xì)胞與門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是形成肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在。
　　 Α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(alpha-1,3 fucosyltransferase，F(xiàn)UT) 是一類催化巖藻化寡糖合成的酶類[1]。參與唾液酸化路易斯抗原（Sialyl Lewis X，SLeX）合成最后一步的巖藻糖化反應(yīng)，有9個亞型[2]。其中α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅳ（FUT4）是SleX合成的關(guān)鍵酶[3]。

3、SLeX是最常表達(dá)在胚胎組織及腫瘤細(xì)胞表面糖脂和糖蛋白上的含有寡聚糖的一組碳水化合物抗原[4，5]。它不僅是三種選擇素（E，L，P-選擇素）最小可識別的配體，而且是腫瘤相關(guān)的糖鏈抗原[6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)SleX抗原強表達(dá)于有關(guān)的腫瘤細(xì)胞表面如結(jié)腸癌、胃癌、肝癌等細(xì)胞，且SleX的表達(dá)水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，手術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)[6，7]。我們前期病理研究[8]也已證實在原發(fā)灶肝癌細(xì)胞SleX表達(dá)陽性率為64.10％，并且存在門脈癌栓、有術(shù)前肝

4、外轉(zhuǎn)移、有衛(wèi)星灶、術(shù)后3月內(nèi)復(fù)發(fā)患者sLeX表達(dá)有更高的陽性率?；谶@一特點，有研究通過單克隆抗體封閉SleX和內(nèi)皮細(xì)胞選擇素（endothelium-selectin，E-selectin）的粘附來阻斷腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，獲得良好效果[9]，另一些研究則通過模擬聚合物的方式來抑制這兩者結(jié)合也取得了一定的效果[10]，但是都有一定的缺點及應(yīng)用局限性。因此總結(jié)前人經(jīng)驗和我們大量前期實驗基礎(chǔ)上，考慮對肝癌HepG2細(xì)胞采用RNA干擾的方法。通過微

5、小干擾RNA(micro-RNA，miRNA)沉默α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因，降低肝癌細(xì)胞表面SleX配體的表達(dá)，從而達(dá)到與E-selectin的相互粘附作用減弱，阻斷肝癌細(xì)胞粘附轉(zhuǎn)移的途徑。
　　 而該實驗成功的必要條件是構(gòu)建高效合適的miRNA干擾載體：從FUT4-mRNA中依據(jù)miRNA設(shè)計原則找出四個最優(yōu)的干擾靶位點，把每個位點序列單獨嵌合在載體上形成miRNA干擾載體，隨后載體擴增和轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過一系列的實驗手段分析

6、比較四個miRNA干擾載體干擾效果，選取最好的干擾載體進(jìn)行下一步的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：1、探討α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅳ基因miRNA干擾對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的意義。
　　 2、構(gòu)建表達(dá)α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅳ基因miRNA序列的載體。
　　 3、鑒定α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅳ基因miRNA序列的沉默效果，篩選出高效的干擾片段及載體。
　　 方法：軟件Cenix bioscience設(shè)計合成

7、針對FUT4-mRNA的FUT4-miRNA四個候選干擾片段。并逐個與pcDNA?6.2-GW/EmGFPmi載體退火連接形成FUT4-miRNA干擾載體；轉(zhuǎn)化單克隆擴增后測序；轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，熒光定量PCR (FQ-PCR)檢測FUT4-mRNA在不同組別的表達(dá)情況，并比較選出沉默效率最好的一組。Western-blot在蛋白質(zhì)水平檢測FUT4蛋白量。實驗分為轉(zhuǎn)染組，陰性對照組及空白組。
　　 結(jié)

8、果：測序結(jié)果證實載體包含有靶基因的miRNA序列，并正確連接，DNA電泳顯示質(zhì)粒純度高，無其他DNA雜質(zhì)。熒光定量PCR結(jié)果說明實驗組FUT4-mRNA比空白對照組少（P＜0.05），陰性對照組和空白對照組沒有明顯差別（P＞0.05）。同時western-blot結(jié)果顯示實驗組FUT4蛋白表達(dá)量和空白對照組比明顯降低（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：1、BLAST分析四組miRNA序列片段與人類原癌基因無同源性，陰性對照序列片段與