黃連素對2型糖尿病腎病大鼠及QDPR基因啟動子的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病(diabetic mellitus，DM)是嚴(yán)重危害國民健康的重大疾病。2010年我國學(xué)者發(fā)表在《New England Journal of Medicine》對我國流行病學(xué)調(diào)查表明:20歲以上成年人DM患病人口為9240萬，而DM前期患病人口約為1.48億。而該數(shù)據(jù)在2013已被刷新。同年發(fā)表在《JAMA》上的數(shù)據(jù)顯示:我國成年人DM患病人口已經(jīng)達(dá)到11.6％，即中國成年人DM患病人口為1.139億，而DM

2、前期人口預(yù)計為為50.1％，即糖尿病前期患病人口為4.934億。糖尿病腎病(diabeticnephropathy, DN)是DM嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，多項流行病學(xué)調(diào)查顯示，DN在我國已經(jīng)成為導(dǎo)致老年終末期腎病的首要原因，是國民健康的嚴(yán)重危險因素，但目前仍然缺乏對其的有效治療手段?；颊咭坏┌l(fā)現(xiàn)大量蛋白尿，其腎功能將進(jìn)行性下降，最終進(jìn)展為終末期腎病。因此，尋找防治DN的有效藥物是醫(yī)學(xué)科研人員的目標(biāo)，以此保證人民健康和提高患者生活治療的迫

3、切需求。
　　黃連素(berberine，BBR)，又名鹽酸小檗堿，是從黃連、黃柏等植物中提取的生物堿。黃連素作為抗菌藥已被臨床廣泛應(yīng)用于痢疾桿菌所致的腸道感染。近年來研究發(fā)現(xiàn)該藥尚能治療DM、高血壓及心律失常等心血管疾病。關(guān)于黃連素對DN的研究越來越受關(guān)注。已有一些對黃連素治療DN的療效觀察及機(jī)制研究，多從改善胰島素抵抗，降低血糖，降低血壓和血脂，抗炎及改善氧化應(yīng)激等方面研究。但目前缺少對黃連素干預(yù)2型DN的長期療效觀察及作用機(jī)

4、制研究。
　　李平教授研究團(tuán)隊在前期差異蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn)，二氫生物喋呤還原酶(dihydropteridine reductase，QDPR)在自發(fā)性2型糖尿病模型OLETF大鼠腎臟損害時，編碼此蛋白的基因發(fā)生點突變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，QDPR可以增加BH4和nNOS基因表達(dá)，下調(diào)TGFβ1，Smad3以及NOXs各亞基的蛋白和基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用;在體外高表達(dá)QDPR可以增強(qiáng)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)自噬活性。因此，Q

5、DPR可能作為DN的潛在生物標(biāo)記物和藥物作用靶點，對QDPR啟動子的研究勢在必行。
　　目的:
　　觀察黃連素對于高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型的腎臟保護(hù)作用，及其機(jī)制是否與抑制炎癥、纖維化和改善脂代謝紊亂有關(guān);構(gòu)建DN相關(guān)基因QDPR啟動子片段，對其啟動子區(qū)域定位，觀察黃連素對其活性影響。
　　方法:
　　1.黃連素對2型DN大鼠的腎臟保護(hù)作用及機(jī)制
　　1.1黃連素對2型DN大鼠的腎臟保護(hù)

6、作用:本實驗通過高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型，給予黃連素連續(xù)灌胃給藥20w。動態(tài)監(jiān)測實驗大鼠測血糖水平，4周一次;每4周收集實驗大鼠24h尿;20周時處死實驗動物，腹主動脈取血，收集血清，日立全自動血生化儀測定各項血生化指標(biāo);收集腎組織用一半用于組織病理學(xué)染色，其余腎組織用于分子生物學(xué)檢測。
　　1.2黃連素通過抑制NF-κB通路減輕2型DN大鼠腎臟炎癥:對高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型，進(jìn)行免疫組織

7、化學(xué)，western blot以及realtime PCR等方法檢測炎癥指標(biāo)(ED-1、IL-1β、TNF-α和MCP-1)，并研究NF-κB炎癥信號通路(p-p65、p65、p-IκBα、IκBα)。
　　1.3黃連素通過抑制TGFβ/Smad通路減輕2型DN大鼠腎臟纖維化:對高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型，進(jìn)行免疫組織化學(xué)，western blot以及realtime PCR等方法檢測纖維化指標(biāo)（collagen

8、Ⅰ、collagenⅣ和Fibronectin），并研究TGFβ/Smad信號通路（TGFβ、pTβRⅠ、TβRⅠ、TβRⅡ、p-Smad2/3，Smad2/3，Smad7，Smurf2）。
　　1.4黃連素通過調(diào)節(jié)LOX-1/ABCA-1平衡改善2型DN大鼠腎臟脂質(zhì)沉積:對高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型，進(jìn)行油紅O染色，western blot以及realtime PCR等方法檢測膽固醇攝入及流出指標(biāo)（LOX-Ⅰ、

9、RXRα、RXRβ和ABCA-1）。
　　2.黃連素對QDPR啟動子功能區(qū)域影響初探
　　2.1 QDPR啟動子功能區(qū)域的構(gòu)建:從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取大鼠QDPR基因組序列，利用啟動子在線分析軟件（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)對該基因起始密碼子ATG5'上游約2kb的序

10、列進(jìn)行分析，對啟動子區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測。采用DNAStar軟件進(jìn)行DNA序列對比和酶切位點分析。利用T-A載體進(jìn)行克隆，而后亞克隆至pGL3-Basic表達(dá)載體，利用酶切鑒定及測序分析判斷啟動子構(gòu)建正確與否。
　　2.2黃連素對QDPR啟動子功能區(qū)域的影響:黃連素（濃度為5μM，10μM）干預(yù)高糖(30mM)刺激瞬時轉(zhuǎn)染有QDPR啟動子不同片段的HEK293T細(xì)胞，通過雙螢光素酶報告基因活性分析，分析黃連素對于QD

11、PR基因啟動子活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.黃連素對2型DN大鼠的腎臟保護(hù)作用及機(jī)制
　　1.1黃連素對2型DN病大鼠的腎臟保護(hù)作用:實驗期間，Normal組大鼠血糖水平穩(wěn)定在正常水平;造模成功后DN組大鼠血糖維持在高水平，黃連素治療第4周開始降低大鼠血糖水平，其作用可持續(xù)至實驗終點。實驗結(jié)束取材時，DN組大鼠腎重指數(shù)明顯高于Normal組大鼠，黃連素治療可顯著改善升高的腎重指數(shù);DN大鼠血清總蛋白及白蛋白水平降低

12、，尿素氮水平升高，而血肌酐水平未見明顯變化;在給予黃連素治療后，白蛋白水平上升，尿素氮水平下降。DN大鼠尿微量白蛋白水平隨著實驗進(jìn)展而上升，在給予黃連素治療第8周開始下降，并持續(xù)至第20周。病理染色可見Normal組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，背靠背排列緊密，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤。DN組大鼠腎小球官腔結(jié)構(gòu)異常，系膜基質(zhì)增生顯著，基底膜增厚;腎小管上皮變性，部分腎小管官腔擴(kuò)張，間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤;黃連素

13、治療明顯減輕DN大鼠腎臟病理改變。
　　1.2黃連素通過抑制NF-κB通路減輕2型DN大鼠腎臟炎癥:在高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠模型腎臟炎癥浸潤明顯，在腎小球及腎小管間質(zhì)充斥巨噬細(xì)胞;給予黃連素治療后，浸潤的巨噬細(xì)胞明顯減少。相似地，一些反應(yīng)炎癥狀態(tài)的指標(biāo)，如MCP-1，TNF-α及IL-1β在DN模型大鼠腎臟中表達(dá)升高，而黃連素治療能夠顯著減少上述指標(biāo)的基因及蛋白水平表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在DN模型大鼠腎臟中，磷酸活化的N

14、F-κB(p-p65)蛋白水平上升，而磷酸化的IκBα(p-IκBα)表達(dá)減少。
　　1.3黃連素通過抑制TGFβ/Smad通路減輕2型DN大鼠腎臟纖維化:2型DN進(jìn)展到20周時，腎臟纖維化明顯:collagenⅠ，collagenⅣ以及Fibronectin在mRNA及蛋白水平都顯著升高;黃連素治療能夠顯著改善DN腎臟纖維化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎臟中磷酸化的TβRⅠ表達(dá)增強(qiáng)，TβRⅡ的改變具有上升趨勢。此外，致病性Smad

15、3磷酸活性增強(qiáng)，保護(hù)性Smad7表達(dá)降低，促進(jìn)Smad7降解的Smurf2表達(dá)上升。黃連素治療能夠降低磷酸化TβRⅠ、磷酸化Smad3及Smurf2表達(dá)，增加Smad7表達(dá)，從而抑制纖維化。
　　1.4黃連素通過調(diào)節(jié)LOX-1/ABCA-1平衡改善2型DN大鼠腎臟脂質(zhì)沉積:在高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠模型表現(xiàn)出明顯的血脂紊亂，包括血液循環(huán)中顯著升高的甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇，高密度脂蛋白膽固醇的變化雖無

16、統(tǒng)計學(xué)意義，但表現(xiàn)出下降趨勢。油紅O染色發(fā)現(xiàn)2型DN大鼠腎臟局部存在大量脂滴沉積。給予黃連素治療后，病變大鼠的脂代謝紊亂得以顯著改善。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，DN狀態(tài)時LOX-1表達(dá)上升而ABCA-1表達(dá)下降，造成膽固醇攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)失衡，繼而發(fā)生脂代謝紊亂;給予黃連素治療后，能夠下調(diào)LOX-1表達(dá)，上調(diào)ABCA-1及其調(diào)節(jié)受體LXR/RXR表達(dá)。
　　2.黃連素對QDPR啟動子功能區(qū)域影響初探
　　2.1 QDPR啟動子功能區(qū)域

17、的構(gòu)建:本實驗成功構(gòu)建含有大鼠QDPR基因翻譯起始位點上游2092bp序列的螢光素酶報告基因重組質(zhì)粒，同時構(gòu)建該區(qū)域缺失片段的螢光素酶報告基因重組質(zhì)粒，通過酶切及測序鑒定確認(rèn)成功構(gòu)建大鼠QDPR基因啟動子片段。
　　2.2黃連素對QDPR啟動子功能區(qū)域的影響:在高脂聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠模型腎臟中，QDPR表達(dá)減少;同樣地，在體外使用高糖誘導(dǎo)HBZY細(xì)胞，QDPR表達(dá)降低。高糖刺激HEK293T細(xì)胞，QDPRp1(QD

18、PR啟動子全片段)的熒光素酶活性顯著降低，而QDPRp2（QDPR啟動子部分缺失片段）的熒光素酶活性顯著升高。然而在給予黃連素干預(yù)高糖刺激后的HEK293T細(xì)胞后，QDPRp1應(yīng)答明顯增強(qiáng)，并且作用呈劑量依賴性;相反地，給予黃連素治療后的QDPRp2應(yīng)答減弱。
　　結(jié)論:
　　1.黃連素對2型糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及機(jī)制:
　　黃連素治療高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠，可顯著降低腎重指數(shù)、血糖、血脂以及尿