玉米赤霉烯酮一步無毒競爭檢測方法的初步建立及其噬菌體結合肽的篩選.pdf

1、目的:利用玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)單抗及其抗獨特型單抗,建立一步無毒免疫學檢測技術;利用噬菌體隨機環(huán)七肽庫淘選出與ZEN單抗1G4不同識別位點的ZEN結合肽,初步驗證其用于建立夾心ELISA法的可行性。
　　方法:(1)對本實驗室前期研制的ZEN單抗細胞株1G4及其抗獨特型單抗細胞株1D5克隆化,篩選出分泌高親和力抗體的細胞株,并制備其腹水型抗體。包被抗獨特型單抗1D5,與辣根過氧化物酶(HRP)標記的ZEN

2、單抗1G4建立一步競爭ELISA方法,實現(xiàn)對ZEN的無毒檢測。(2)包被抗獨特型抗體1D5,與待測物競爭性結合辣根過氧化物酶標記的單抗1G4,以魯米諾-辣根過氧化物酶-過氧化氫為檢測系統(tǒng),建立一步競爭化學發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA),并對反應條件進行初步優(yōu)化。(3)以ZEN-1G4抗原抗體復合物為靶分子,對噬菌體隨機環(huán)七肽庫進行3輪免疫親和篩選;分別以ZEN-1G4復合物或1G4為包被物,夾心ELISA篩選出與1G4識別不同位點的ZE

3、N結合肽噬菌體單克隆,并初步驗證其用于建立ZEN的夾心ELISA檢測法的可行性。
　　結果:(1) ZEN的直接競爭ELISA標準曲線的回歸方程為y=-30.195x+61.622,(R2=0.9849)其中y為抑制率,x為競爭物濃度的對數(shù),檢測范圍（IC80-IC20)為0.25ng/mL-24.12ng/mL,半抑制率 IC50為2.426ng/mL,檢測限為0.114ng/mL;(2)ZEN的直接競爭化學發(fā)光免疫分析法標準曲

4、線的回歸方程為y=-40.205x+46.303(R2=0.9799),檢測范圍（IC20-IC80)0.145ng/mL-4.51ng/mL,IC50為0.8ng/mL,檢測限為0.081ng/mL;(3)通過3輪篩選,隨機挑取40個噬菌斑進行夾心ELISA鑒定,結果顯示有2株噬菌體克隆與1G4-ZEN的結合親和力略高于與1G4的,但進行ZEN梯度濃度檢測未顯示有差別。
　　結論:1、利用ZEN單抗及其抗獨特型抗體成功建立了ZE