一株高效降解玉米赤霉烯酮細(xì)菌的研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮(zearaleonoe，ZEN)是鐮刀菌屬產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)烈的雌激素效應(yīng)，是當(dāng)前污染我國(guó)糧油食品主要真菌毒素之一。ZEN不僅導(dǎo)致我國(guó)糧食生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖和外貿(mào)出口遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并且威脅著人類的健康。如何消減糧食和飼料中的ZEN，降低其危害已經(jīng)成為目前亟待解決的問(wèn)題。目前ZEN的消減技術(shù)主要分為物理法、化學(xué)法和生物法。生物技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)的物理化學(xué)法具有專一、清潔、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的前景。本研究旨在篩選可

2、以高效降解ZEN的微生物并研究其降解特性，降解機(jī)理，并利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)相關(guān)降解基因進(jìn)行研究，為消減糧食和飼料中的ZEN提供基礎(chǔ)支持。
　　本研究以ZEN為唯一碳源，通過(guò)對(duì)沼氣污泥和河邊淤泥中的微生物富集培養(yǎng)，篩選到兩株高效降解ZEN的菌株，分別命名為ASAG16、ASAG17。通過(guò)形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析的方法，初步鑒定ASAG16為香茅醇假單胞，ASAG17為斯氏假單胞，并對(duì)ASAG16菌株進(jìn)行了深入研究。

3、　　本文還研究了培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、pH、金屬離子不同因素對(duì)ASAG16降解ZEN的影響，結(jié)果表明:ASAG16在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)和溶菌肉湯培養(yǎng)基(LB)中均對(duì)ZEN具有良好的降解效果，其中在含20 mg·L-1的LB中，培養(yǎng)6d，ZEN降解率可達(dá)91.59％。培養(yǎng)時(shí)間、pH和金屬離子對(duì)ASAG16降解ZEN的效果影響較大。在ASAG16菌株生長(zhǎng)前期，降解率隨時(shí)間延長(zhǎng)快速上升;在后期降解率趨于穩(wěn)定。在pH4的LB培養(yǎng)基中，ZEN的降

4、解率為20.83％，在pH5～9時(shí)，ZEN的降解率都在75％以上，因此降解率隨pH的升高而逐漸加大;研究還表明:Mg2+、Ca2+、Mn2+對(duì)ASAG16降解ZEN效果影響不明顯，而Cu2+、Zn2+、Co2+、Ba+和EDTA則嚴(yán)重抑制ASAG16對(duì)ZEN的降解能力。
　　在完成以上研究的基礎(chǔ)上，又對(duì)ASAG16的降解ZEN的機(jī)理進(jìn)行了初步研究。發(fā)酵液上清液和破碎后上清液對(duì)ZEN的降解率分別為12.06％和47.66％，而滅活的

5、上清液幾乎沒(méi)有降解效果，初步推斷該菌對(duì)ZEN的消減是ZEN的降解作用而非吸附。質(zhì)譜分析，經(jīng)菌株ASAG16降解后，ZEN的豐度明顯降低，同時(shí)產(chǎn)生了m/z=319.1547和m/z=325.070的兩種新物質(zhì)。m/z=319.1547物質(zhì)和ZEN的碎片離子種類及豐度相似，證明m/z=319.1547物質(zhì)為ZEN的一種代謝產(chǎn)物。推導(dǎo)表明m/z=319.1547物質(zhì)可能是在ZEN結(jié)構(gòu)上加成兩個(gè)H原子，是破壞碳碳雙鍵或者碳氧雙鍵導(dǎo)致的。

6、　　進(jìn)一步研究了該菌株分子生物學(xué)特性。利用攜帶Mini-Tn5轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒pJB15A構(gòu)建了香茅醇假單胞ASAG16的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變體庫(kù)。獲得了15000株具有卡那霉素抗性的突變子。篩選獲得一株ZEN降解效果降低的突變子，命名為zen-1。通過(guò)對(duì)基因組的酶切，酶切產(chǎn)物的自連、轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，克隆獲得重組質(zhì)粒。通過(guò)測(cè)序獲得了轉(zhuǎn)座子攜帶的側(cè)翼基因序列。通過(guò)NCBI的對(duì)比與分析，側(cè)翼序列與Nitric oxide reductase tr