玉米赤霉烯酮誘發(fā)睪丸間質(zhì)腫瘤機(jī)制的體外研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)是存在于谷物、啤酒、牛奶等食品中的類雌激素霉菌毒素，可嚴(yán)重影響動(dòng)物及人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)ZEA不僅具有生殖毒性、肝毒性、遺傳毒性、免疫毒性，還可引起動(dòng)物睪丸間質(zhì)腫瘤的發(fā)生，但關(guān)于ZEA誘發(fā)睪丸間質(zhì)腫瘤的機(jī)制目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM3細(xì)胞）為材料，研究了低濃度的ZEA暴露對(duì)TM3細(xì)胞的細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及其相關(guān)調(diào)控蛋白的影響，DNA損傷及原癌、抑癌基因的影響，

2、細(xì)胞間隙連接通訊及其連接蛋白的影響，以揭示ZEA誘發(fā)睪丸間質(zhì)腫瘤的機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.ZEA對(duì)TM3細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。不同濃度的ZEA(0、5、10、20μg/L)，染毒TM3細(xì)胞72h，應(yīng)用MTT法檢測(cè)ZEA染毒后對(duì)TM3細(xì)胞增殖活力的影響;AnnexinⅤ-FITC/PI雙熒光染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ZEA染毒TM3細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)通過PI熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞周期的變化;通過免疫印跡法(W

3、estern Blot)檢測(cè)凋亡調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4，Bcl-2基因家族成員的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，低濃度ZEA對(duì)TM3細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，在ZEA染毒濃度為20μg/L時(shí)，TM3細(xì)胞的相對(duì)增殖活力明顯提高(P＜0.05);ZEA染毒后，分布于G1/G0期的TM3細(xì)胞量逐漸減少，開始向S期和G2期進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表達(dá)量隨ZEA染毒濃度的升高而

4、呈上升趨勢(shì);細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，10、20μg/L ZEA染毒后TM3細(xì)胞的凋亡率極顯著下降(P＜0.01)，但20μg/L ZEA染毒組較10μg/L ZEA染毒組凋亡率略有上升(P＞0.05);與對(duì)照組比較，各染毒組凋亡調(diào)控蛋白Bax/Bcl-2灰度值比值均顯著降低(P＜0.05)。
　　2.ZEA對(duì)TM3細(xì)胞DNA損傷及原癌、抑癌基因的調(diào)控作用。ZEA染毒TM3細(xì)胞72h，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)磷酸化組蛋白γH2

5、AX的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)原癌基因c-Myc、 c-Fos、 c-Jun，抑癌基因p53、PTEN的蛋白表達(dá)水平;免疫熒光法檢測(cè)γH2AX熒光焦點(diǎn)的形成情況。結(jié)果顯示，TM3細(xì)胞內(nèi)形成的γH2AX熒光焦點(diǎn)數(shù)量及形成熒光焦點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量都隨著ZEA染毒濃度的升高而增加，20μg/L ZEA染毒組只有26.21％的細(xì)胞未形成熒光焦點(diǎn)，其余細(xì)胞均有不同程度的DNA損傷;與對(duì)照組比較，各染毒組γH2AX蛋白表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05);隨著

6、ZEA染毒濃度的升高，原癌基因c-Myc、c-Fos、c-Jun蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，各染毒組與對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0.05)，相反抑癌基因p53及PTEN蛋白表達(dá)水平則呈下降趨勢(shì)，且差異極顯著(P＜0.01)。
　　3.ZEA對(duì)TM3細(xì)胞間隙連接通訊及其連接蛋白的影響。ZEA染毒TM3細(xì)胞72h。Western Blot檢測(cè)細(xì)胞間隙連接蛋白Cx32、Cx43的蛋白表達(dá)水平;FITC熒光染料染色Cx43，在熒光顯微鏡下觀

7、察Cx43在細(xì)胞內(nèi)的分布情況;劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)(SLDT法）檢測(cè)TM3細(xì)胞暴露于ZEA后，相鄰細(xì)胞之間GJIC功能的變化。結(jié)果顯示，隨著ZEA染毒濃度的升高，TM3細(xì)胞連接蛋白Cx32、Cx43的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，各染毒組與對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0.05);熒光顯微鏡下觀察到Cx43在正常細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)點(diǎn)線狀結(jié)構(gòu)分布于細(xì)胞膜周圍，然而在ZEA染毒后Cx43原有的點(diǎn)線狀結(jié)構(gòu)遭受破壞，熒光強(qiáng)度減弱，其分布逐漸趨向于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核膜上;

8、SLDT技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小分子染料熒光黃(LY)在相鄰細(xì)胞間的擴(kuò)散距離隨著ZEA染毒濃度的升高而呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)，10μg/L ZEA以上染毒組均較對(duì)照組有極顯著差異(P＜0.01)，表明GJIC功能受到了ZEA的抑制。
　　結(jié)論認(rèn)為，低劑量ZEA可引起TM3細(xì)胞DNA的損傷，同時(shí)伴隨原癌、抑癌基因及凋亡調(diào)控蛋白Bal-2、Bax表達(dá)的異常及細(xì)胞間隙連接通訊的抑制，這些被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。ZEA可導(dǎo)致TM3細(xì)胞基因組穩(wěn)定性降低，其