雌激素預(yù)防早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察生理濃度的雌二醇(E<,2>)在不同氧環(huán)境下，對培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BRECs)的影響及對SD大鼠早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)模型視網(wǎng)膜新生血管形成的影響，探討E<,2>對ROP的預(yù)防作用以及可能的作用機(jī)理。 方法： 1.以培養(yǎng)的BRECs為模型，在正常O<,2>環(huán)境及缺O(jiān)<,2>環(huán)境下，給予不同生理濃度的E<,2>(濃度分別為10<'-12>，10<'-10>，10<'-8>mol／L)或PBS作用

2、不同時間(8h，24h)，RT-PCR檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA、低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)mRNA、一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表達(dá)。硝酸還原酶法測定NO的釋放。 2.制造SD大鼠ROP模型，分別在高O<,2>[(75±2)％O<,2>]飼養(yǎng)(P1-7)及正常空氣飼養(yǎng)(P8-14)階段或全程(P1-14)中，給予皮下注射E<,2>(1ug／rat／day，E<,2>溶解于乙醇，用PBS稀釋為0.1m

3、L／rat)或皮下注射溶媒(PBS)0.1mL／rat／day，每日觀察新生鼠的發(fā)育情況。生后7天(P7)、14天(P14)，各組鼠分別隨機(jī)取3只，腹腔麻醉后，心腔穿刺并注射墨汁，行視網(wǎng)膜鋪片，觀察視網(wǎng)膜血管發(fā)育情況；斷頭處死動物，摘除眼球，RT-PCR檢測視網(wǎng)膜VEGFmRNA、HIF-lαmRNA、eNOSmRNA的含量；生后14天(P14)的眼球行組織切片HE染色，觀察視網(wǎng)膜新生血管生長情況；免疫組化染色，觀察VEGF蛋白的表達(dá)；

4、透射電鏡觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1.BRECs VEGFmRNA、HIF-1αmRNA、eNOSmRNA的表達(dá)： 1-1.低O<,2>條件下BRECs的HIF-1αmRNA、VEGFmRNA、eNOSmRNA表達(dá)較正常O<,2>條件下明顯增多(P<0.05)，且VEGFmRNA、HIF-1αmRNA兩者之間有明顯的相關(guān)性(r=0.82)。 1-2.正常O<,2>條件下，給予不同生理濃度E<,2

5、>(10<'-12>,10<'-10>,10<'-8>mol／L)作用24h，顯示E<,2>呈濃度依賴性促進(jìn)BRECs的VEGFmRNA、eNOSmRNA表達(dá)(P<0.05)。10<'-8>mol／L E<,2>作用8、24h，VEGFmRNA、eNOSmRNA表達(dá)量呈時間依賴性增多(P<0.05)；E<,2>不影響HIF-1αmRNA的含量(P>0.05)。 1-3.低O<,2>條件下，給予不同生理濃度E<,2>(10<'-

6、12>,10<'-10>,10<'8>mol／L)作用24h，顯示E<,2>呈濃度依賴性抑制BRECs的HIF-1αamRNA、VEGFmRNA表達(dá)(P<0.05)，增加eNOSmRNA表達(dá)(P<0.05)。10<'-5>mol／L E<,2>作用8、24h，HIF-1ctmRNA、VEGFmRNA表達(dá)量呈時間依賴性降低(P<0.05)，eNOSmRNA表達(dá)量呈時間依賴性增多(P<0.05)。他莫昔芬可逆轉(zhuǎn)E<,2>的作用。

7、2．BRECs NO的含量：缺O(jiān)<,2>條件下BRECs的NO釋放較正常O<,2>條件下明顯增多(P<0.05)。給予不同生理濃度E<,2>(10<'12>，10<'-10>，10<'-8>mol／L)作用24h，正常O<,2>及缺O(jiān)<,2>條件下，E<,2>均呈濃度依賴性地增加BRECs的NO釋放(P<0.05)。10<'-8>mol／L E<,2>作用8、24 h，正常O<,2>及缺O(jiān)<,2>條件下，BRECs的NO釋放均呈時間依賴

8、性增多(P<0.05)。他莫昔芬可逆轉(zhuǎn)E<,2>的作用。 3．視網(wǎng)膜鋪片：P7和P14時，正常O<,2>條件下，給予溶媒或E<,2>，均無明顯毛細(xì)血管無灌注區(qū)及新生血管芽(P>0.05)。吸入高濃度O<,2>同時補(bǔ)充E<,2>，P7時顯示視網(wǎng)膜血管發(fā)育較給予溶媒者成熟，無灌注區(qū)明顯少(P<0.05)。P14時，P1-14全程補(bǔ)充E<,2>較給予溶媒者，血管發(fā)育良好，無灌注區(qū)少，未見新生血管芽(P<0.05)；全程給予溶媒或僅P

9、1-7給予E<,2>，與對照組1相比，可見大量無灌注區(qū)及新生血管芽(P<0.05)；P7-14給予E<,2>，亦可見較多無灌注區(qū)及新生血管芽(P<0.05)。 4．組織學(xué)研究： 4-1.HE染色：突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)六組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常O<,2>條件下，給予溶媒或E<,2>，內(nèi)皮細(xì)胞均極少(P>0.05)。吸入高濃度O<,2>，新生血管較多，有的形成血管索，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)較正常O<,2>條件下明顯

10、增多(P<0.05)。P1-14全程補(bǔ)充E<,2>，內(nèi)皮細(xì)胞較吸入高濃度O<,2>給予溶媒者明顯減少(P<0.05)，達(dá)正常O<,2>條件下內(nèi)皮細(xì)胞水平(P>0.05)。P1-7或P8-14補(bǔ)充E<,2>，內(nèi)皮細(xì)胞較正常O<,2>條件下亦明顯增多(P<0.05)。 4-2.免疫組化：P14時，CD<,34>和VEGF在突破內(nèi)界膜的細(xì)胞呈陽性表達(dá)。VEGF半定量測定顯示平均灰度值及面密度值六組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

11、。正常O<,2>條件下，給予溶媒或E<,2>，VEGF均不表達(dá)(P>0.05)。吸入高濃度O<,2>給予溶媒者，VEGF表達(dá)量較正常O<,2>條件下明顯增多(P<0.05)(平均灰度值低，面密度值高)；P1-14全程補(bǔ)充E<,2>，VEGF表達(dá)量較吸入高濃度O<,2>給予溶媒者明顯減少(P<0.05)，與正常02條件下表達(dá)量相當(dāng)(P>0.05)。P1-7或P8-14補(bǔ)充E<,2>，VEGF表達(dá)量較正常O<,2>條件下亦明顯增多(P<0.

12、05)。進(jìn)一步證實(shí)：正常O<,2>條件下，E<,2>不引起視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生。吸入高濃度O<,2>，可誘發(fā)新生血管，P1-14全程補(bǔ)充E<,2>可明顯減少新生血管形成。 5.透射電鏡觀察：正常O<,2>條件下，給予溶媒或E<,2>，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞核圓形或橢圓形，核周隙無擴(kuò)大，染色質(zhì)分布均勻，線立體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。吸入高濃度O<,2>，視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)受損。視細(xì)胞層變薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)淡染、線粒

13、體空泡形成。P1-14全程補(bǔ)充E<,2>，視網(wǎng)膜損傷明顯減輕，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)正常，排列有序，染色質(zhì)分布均勻。P8-14、P1-7給予者視細(xì)胞層薄，可見線粒體空泡。 6.視網(wǎng)膜RT-PCR：P7、P14時各組視網(wǎng)膜VEGFmRNA、HlF-1atmRNA及eNOSmRNA表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常氧環(huán)境下飼養(yǎng)(P1-7)，P7、P14時顯示E<,2>可增加VEGF、eNOSmRNA的表達(dá)(P<0.05)；吸入高氧時(

14、P1-7)，視網(wǎng)膜VEGFmRNA表達(dá)下降、eNOSmRNA表達(dá)增多，補(bǔ)充E<,2>可增加VEGF、eNOSmRNA的表達(dá)(P<0.05)，P7時VEGFmRNA幾乎逆轉(zhuǎn)至正常氧環(huán)境下水平(p>0.05)。正常氧及吸入高氧時，E<,2>對HIF-1a無影響(p>0.05)。吸入高氧再返回正常氧環(huán)境下飼養(yǎng)(P8-14)，P14時視網(wǎng)膜VEGF、HIF-1a、eNOSmRNA高表達(dá)，P1-14全程給予E<,2>，P14時視網(wǎng)膜HIF-1am

15、RNA、VEGFmRNA含量顯著降低，eNOSmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。P1-7或P8-14補(bǔ)充E<,2>，則HIF-1amRNA、VEGFmRNA降低不明顯(P>0.05)。 7．全身發(fā)育：各組鼠體重增長相當(dāng)(p>0.05)，全身發(fā)育未見明顯異常。 結(jié)論： 1．模型：在培養(yǎng)液中加入COCl<,2>進(jìn)行缺氧細(xì)胞培養(yǎng)，具有簡單、重復(fù)性好、不受外界環(huán)境影響的優(yōu)點(diǎn)，是模擬缺氧環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)的有效方法。高氧誘導(dǎo)

16、的ROP模型，視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生率高，重復(fù)性好，是研究視網(wǎng)膜新生血管形成機(jī)制及探討藥物療效的理想動物模型。 2．機(jī)制：低O<,2>誘導(dǎo)BRECs的HIF-1amRNA、VEGFmRNA、eNOSmRNA表達(dá)及NO釋放增多。HIF-1a-VEGF系統(tǒng)是ROP視網(wǎng)膜新生血管形成的中心環(huán)節(jié)。吸入高濃度O<,2>，VEGFmRNA表達(dá)減少，視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)增多；返回正常O<,2>環(huán)境，由于相對缺O(jiān)<,2>，通過HlF-1amRNA增加

17、VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，形成視網(wǎng)膜新生血管。NO體系參與ROP的形成過程。 3．E<,2>的作用： 3-1．生理濃度的E<,2>對VEGFmRNA具有雙重調(diào)控作用：高氧或正常氧條件下促進(jìn)BRECs及視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)，促進(jìn)視網(wǎng)膜血管發(fā)育；低氧條件下通過HIF-1αmRNA降低VEGFmRNA及蛋白的表達(dá)，抑制視網(wǎng)膜新生血管形成，并呈劑量、時間依賴性。 3-2.生理濃度的E<,2>呈劑量、時間依賴性增加BRE