蜈蚣三七提取物抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分子免疫機(jī)理的研究.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)是最常見(jiàn)和致殘率最高的骨關(guān)節(jié)疾病之一，主要病理環(huán)節(jié)包括免疫功能失常，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞聚積與滑膜增厚，關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞三個(gè)方面。本實(shí)驗(yàn)利用國(guó)際上研究RA通用的膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)先進(jìn)的技術(shù)方法和實(shí)驗(yàn)手段，從動(dòng)物整體模型、關(guān)節(jié)組織、細(xì)胞和分子等不同層面進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究，探討中藥蜈蚣三七提取物治療RA的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理，為日后大規(guī)模應(yīng)用于臨床提

2、供理論依據(jù)。 1蜈蚣三七提取物對(duì)CIA小鼠組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變的影響 采用Ⅱ型膠原制作CIA小鼠模型，設(shè)立模型組、雷公藤組、蜈蚣三七提取物大、中、小劑量組、正常組及正常給蜈蚣三七提取物組，造模7d后開(kāi)始灌胃給藥，于28d、36d分別處死1/2動(dòng)物觀察各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果如下。 (1)取小鼠尾、趾關(guān)節(jié)用10％甲醛溶液固定、EDTA-Na2軟化，石蠟包理切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。皮下軟組織充血或水腫情況：蜈蚣三

3、七提取物各劑量組、雷公藤組均能減輕關(guān)節(jié)軟組織充血、水腫程度，但以蜈蚣三七提取物小劑量組最為顯著。滑膜充血水腫情況：蜈蚣三七提取物各劑量組、雷公藤組均能不同程度的減輕滑膜充血、水腫程度，但以蜈蚣三七提取物小劑量組最為顯著?；ぴ錾闆r：蜈蚣三七提取物各劑量組、雷公藤組均能不同程度的抑制滑膜增生，以蜈蚣三七提取物小劑量組最為顯著。滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況：蜈蚣三七提取物各劑量組、雷公藤組均能減少局部炎性細(xì)胞的滲出，其中以蜈蚣三七提取物小劑量組最

4、為顯著。軟骨增生情況：蜈蚣三七提取物各劑量組和雷公藤組均有不同程度的抑制CIA小鼠趾、尾關(guān)節(jié)部軟骨細(xì)胞增生的作用，以小劑量組最為顯著。 (2)取小鼠尾、趾關(guān)節(jié)用戊二醛溶液固定、軟化作電鏡觀察。正常給藥組：正?；蛹?xì)胞性?xún)?nèi)膜由2-3層滑膜細(xì)胞組成，滑膜細(xì)胞疏松地平行排列，分為3型。A型細(xì)胞形似吞噬細(xì)胞，胞漿以線(xiàn)粒體為主，含小泡和溶酶體。B型細(xì)胞形似成纖維細(xì)胞，胞漿內(nèi)富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量空泡和線(xiàn)粒體。AB型細(xì)胞，兼有兩種細(xì)胞的特點(diǎn)

5、。模型組：滑膜層細(xì)胞內(nèi)膜明顯增厚，多達(dá)5～6層，滑膜細(xì)胞增生肥大，排列紊亂。細(xì)胞器變形，甚至消失，胞質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)大量空泡，胞核染色質(zhì)分布不均。有的細(xì)胞因變性、壞死至萎縮，僅見(jiàn)到細(xì)胞碎塊與大量膠原纖維交錯(cuò)排列。蜈蚣三七提取物小劑量組滑膜層細(xì)胞性?xún)?nèi)膜無(wú)增厚，細(xì)胞排列均勻。偶見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。A型細(xì)胞以初級(jí)溶酶體多見(jiàn)、線(xiàn)粒體稍增多。B型細(xì)胞的胞漿內(nèi)富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖小體。各型細(xì)胞接近正常。中劑量組滑膜層細(xì)胞性?xún)?nèi)膜增厚不明顯，細(xì)胞間質(zhì)稍稀疏，少

6、量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。大劑量組滑膜層細(xì)胞性?xún)?nèi)膜增生明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞滲到滑膜液中，超微結(jié)構(gòu)基本正常。雷公藤組：滑膜層細(xì)胞性?xún)?nèi)膜增生，可見(jiàn)單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿內(nèi)未見(jiàn)分泌顆粒，間或纖維細(xì)胞，線(xiàn)粒體豐富，胞核多有凹陷，各型細(xì)胞接近正常。 2蜈蚣三七提取物對(duì)CIA小鼠外周血及尾關(guān)節(jié)部相關(guān)CD分子及細(xì)胞因子的影響 取CIA小鼠外周血，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)CD4、CD2、CD28、CD80、CD86、CD30、C

7、D45、CD54、Fas(CD95)、CD106、CD137、CTLA-4(CD152)、CD154、CD25；取CIA小鼠血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-10、IL-4、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-6；取CIA小鼠尾關(guān)節(jié)切片，免疫組織化學(xué)技術(shù)(ICH)檢測(cè)Fas、Fas-L、IL-4、IL-10。結(jié)果蜈蚣三七提取物可提高CTLA-4、Fas、Fas-L、IL-4、IL-10IL-12、IFN-γ的表達(dá)水平，降

8、低IL-6、CD4、CD2及CD106的表達(dá)，對(duì)上述其他CD分子及細(xì)胞因子無(wú)明顯作用。 3蜈蚣三七提取物對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞CTLA-4、sFasmRNA及TLR-4表達(dá)的影響 分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，ConA激發(fā)后，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CTLA-4、sFasmRNA；采用FCM檢測(cè)TLR-4。結(jié)果蜈蚣三七提取物可使ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞CTLA-4、sFasmRNA的表達(dá)水平趨于正常；TLR-4的表達(dá)未