SLC25A38基因在急性淋巴細胞白血病細胞中的表達及其功能的初步研究.pdf

1、目的:
　　急性淋巴細胞性白血病(ALL)是一類造血干細胞來源的惡性克隆性疾病，近年來，靶向殺傷治療已成為ALL治療的發(fā)展趨勢，分析ALL發(fā)生機制、尋找新的治療靶點成為研究熱點。溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族(solutecarrier，SLC)是細胞內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)運蛋白家族，主要功能是介導線粒體基質(zhì)與膜間隙或膜間隙與細胞質(zhì)之間的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運，為線粒體提供正常運轉(zhuǎn)所需的物質(zhì)保障。SLC25A38基因定位于染色體3p22，是一種氨基酸載體，初步研究結(jié)

2、果證實，SLC25A38蛋白與神經(jīng)細胞的凋亡和退行有密切聯(lián)系，在造血器官（胚鼠肝臟和骨髓）中大量表達，可能與造血細胞的增殖分化有關(guān)。為了探討SLC25A38基因?qū)Π籽〖毎鲋场⒎只挠绊?，分析其與ALL患者臨床特征的關(guān)系，我們設(shè)計了本實驗。
　　方法:
　　1.收集55例初治急性淋巴細胞白血病患者（其中兒童23例、成人32例）做為實驗組，20例非惡性血液病患者（其中兒童10例，成人10例）做為對照組。通過實時熒光定量RT-

3、PCR及Westernblot方法檢測SLC25A38基因在mRNA和蛋白表達水平的變化。分析SLC25A38蛋白表達與ALL患者初診時臨床特征、化療反應(yīng)和療效之間的關(guān)系。對部分成人SLC25A38蛋白表達陽性患者進行隨訪，檢測不同疾病狀態(tài)下SLC25A38蛋白表達水平的變化。
　　2.用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞株(RPMI8226及U266細胞)和白血病細胞株（K562、MOLT-4及Jurk

4、at細胞）。通過Westernblot方法檢測SLC25A38蛋白在各細胞株的表達水平，同時檢測Notch1蛋白在各細胞株和成人ALL患者中的表達水平。
　　3.以高表達SLC25A38蛋白的Jurkat細胞為模型，構(gòu)建針對SLC25A38基因的shRNA，轉(zhuǎn)染Jurkat細胞并經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。實驗分4組:SLC25A38-shRNA1組（Sh1組）、SLC25A38-shRNA2組（Sh2組）、scramble-sh

5、RNA組（NC組）和Jurkat空白對照組（Ctrl組）。Westernblot和實時定量RT-PCR檢測各組細胞SLC25A38蛋白和mRNA的表達情況。MTT法檢測細胞增殖情況;流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡情況;給予不同濃度阿霉素作用后，流式細胞術(shù)檢測各組不同濃度阿霉素作用下細胞凋亡情況變化。
　　結(jié)果:
　　1.SLC25A38基因在ALL細胞中的表達:mRNA水平分組中，將對照組mRNA相對表達量設(shè)定為1。兒童組

6、中＜1組ALL患兒SLC25A28mRNA的相對表達量為0.2659±0.2874，＞1組的相對表達量為3.1418±1.0607，兩組SLC25A38mRNA的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001)。成人組中＜1組ALL患者SLC25A28mRNA的相對表達量為0.3200±0.3382，＞1組的相對表達量為1.6707±0.6094，兩組SLC25A38mRNA的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0003)。蛋白水平分組中

7、，兒童ALL組SLC25A38蛋白陽性率34.78％(8/23);成人組蛋白陽性率46.9％(15/32);20例對照組均未檢測到SLC25A38蛋白表達。
　　2.臨床特征、治療反應(yīng)和療效:mRNA水平分組中，兒童及成人小于對照組（＜1組）與大于對照組（＞1組）兩組患者在性別、年齡、免疫分型、初診時外周血白細胞數(shù)、血紅蛋白量、血小板、骨髓原始細胞數(shù)等臨床特征之間的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。蛋白水平分組中，兒童ALL組S

8、LC25A38蛋白表達陽性組與陰性組在性別、免疫分型、初診時外周血白細胞數(shù)、乳酸脫氫酶之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而兩組在年齡、初診時外周血血紅蛋白數(shù)、血小板、骨髓原始細胞數(shù)、初診時肝脾大、出血、淋巴結(jié)腫大、初診時CNSL/TL、潑尼松反應(yīng)、完全緩解率與復發(fā)率之間的差別沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;成人ALL組SLC25A38蛋白表達陽性組較陰性組初診時外周血白細胞數(shù)升高(P＜0.05)，而兩組在性別、免疫分型、初診時外周

9、血血紅蛋白數(shù)、血小板、骨髓原始細胞數(shù)之間的差別沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.蛋白水平與腫瘤負荷:隨訪觀察2例SLC25A38蛋白陽性的成人ALL患者發(fā)現(xiàn)，給予聯(lián)合化療達血液學緩解后，其SLC25A38蛋白表達水平明顯下降甚至消失，而疾病復發(fā)時再次出現(xiàn)，且其表達水平與復發(fā)時骨髓原始細胞比例呈正相關(guān)性。
　　4.白血病細胞株中SLC25A38蛋白的表達:5種骨髓瘤或白血病細胞株均表達SLC25A38蛋白，其中以Jur

10、kat細胞表達量最高。
　　5.對Notch蛋白表達的影響:對各骨髓瘤或白血病細胞株及成人ALL樣本同時檢測Notch1蛋白發(fā)現(xiàn)，SLC25A38蛋白與Notch1蛋白在各細胞株及成人ALL樣本中均存在共同表達。
　　6.SLC25A38基因沉默對白血病細胞增殖的影響:MTT結(jié)果表明，Sh1組和Sh2組細胞的OD490值明顯高于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義沉默SLC25A38基因后Jurkat細胞的增殖加快。<

11、br>　　7.SLC25A38基因沉默對白血病細胞周期影響:流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果表明，Sh1組和Sh2組細胞G0/G1期比例減少，S期與G2/M期比例增加，表明基因沉默后Jurkat細胞生長加快。
　　8.SLC25A38基因沉默對白血病細胞凋亡影響:SLC25A38基因沉默后，各組細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;給予不同濃度阿霉素作用后，Sh1組和Sh2組細胞只比對照組細胞凋亡率有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義

12、(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.SLC25A38基因異常表達在兒童和成人ALL中是一種普遍的現(xiàn)象，但mRNA表達與蛋白表達水平不一致。
　　2.SLC25A38蛋白高表達與ALL患者外周血白細胞數(shù)等臨床特征相關(guān)，且與ALL腫瘤負荷有關(guān)。
　　3.通過shRNA技術(shù)成功靶向沉默SLC25A38基因可以促進Jurkat白血病細胞增殖，對細胞凋亡過程無顯著影響。
　　4.沉默SLC25A38基因不影響Ju