單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、目的：近年來研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)可以體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，因此BMSCs有望成為神經(jīng)細(xì)胞移植的種子細(xì)胞來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但BMSCs定向誘導(dǎo)分化率低，且分化后的細(xì)胞存活時間短而不能有效增殖以滿足移植的需要。如何能夠找到穩(wěn)定高效的誘導(dǎo)方法及提高誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞的存活率是需要解決的一個關(guān)鍵問題。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialotetrahexosyl gan

2、glioside，GM1)在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化、修復(fù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有相當(dāng)重要的作用。研究表明，GM1有誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用，本文就不同濃度GM1對BMSCs的誘導(dǎo)分化作用作一探討。 方法：以全骨髓培養(yǎng)法分離成人BMSCs，進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面CD44，CD45，CD90，CD105的表達(dá)以鑒定純度。以含有10μg/ml、60μg/ml、90μg/ml GM1的DMEM無血清培養(yǎng)基誘

3、導(dǎo)第五代的BMSCs，陰性對照組不加任何誘導(dǎo)劑。至誘導(dǎo)后7d觀察細(xì)胞形態(tài)變化并計數(shù)，誘導(dǎo)后6h以免疫細(xì)胞化學(xué)法測定各組細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白(MAP-2)，以鑒定是否誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞并計算分化百分率。各組間分化百分率進(jìn)行比較和統(tǒng)計學(xué)處理。并用MTT法測定誘導(dǎo)后0.5h、6h、24h、3d細(xì)胞生長狀況。 結(jié)果：細(xì)胞接種2天后給予PBS沖洗，全量換液可見貼壁細(xì)胞呈集落狀生

4、長。8～10天后細(xì)胞可基本鋪滿瓶底，為均一梭狀細(xì)胞。以1：3比例傳代，傳代后1天左右細(xì)胞可以恢復(fù)活力并貼壁生長，5～6天后可鋪滿瓶底。傳代至4～5代時細(xì)胞形態(tài)比較均一，混雜細(xì)胞較少。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD44(+)，CD90(+)，CD105(+)，CD45(—)，基本證實BMSCs的純度。BMSCs經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積增大，形態(tài)變長。加入誘導(dǎo)液30～40 min后，細(xì)胞開始發(fā)生形態(tài)變化，胞體向內(nèi)收縮，呈球形或圓形，并向周圍長出

5、突起，有立體感，折光性增強；誘導(dǎo)4 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體進(jìn)一步收縮形成突起，胞體立體感增強，周圍出現(xiàn)光暈，可見到很多雙極和多極細(xì)胞；6 h后大多數(shù)細(xì)胞形成錐形、三角形等不規(guī)則形狀，突起增多變長，細(xì)胞間突起相互連接，交錯成網(wǎng)，呈現(xiàn)典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。到誘導(dǎo)后3天，神經(jīng)元樣細(xì)胞增多不明顯。5天后有少量細(xì)胞懸浮死亡，突起延長多交織成網(wǎng)狀；7天時細(xì)胞形態(tài)與5天時基本相同，但懸浮死亡細(xì)胞較多。陰性對照組細(xì)胞仍呈均一長梭狀細(xì)胞，但細(xì)胞

6、生長速度明顯減慢。細(xì)胞誘導(dǎo)6 h免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同濃度GM1組和陰性對照組細(xì)胞均有MAP-2，NSE表達(dá)，但未檢測到GFAP的表達(dá)。10μg/ml、60μg/ml、90μg/ml GM1組NSE、MAP-2細(xì)胞陽性率均較陰性對照組明顯高(P＜0.05)。組間比較：60μg/ml、90μg/ml組NSE、MAP-2細(xì)胞陽性率均較10μg/ml組高(P＜0.05)，60μg/ml、90μg/ml組細(xì)胞陽性率差異不顯著(P＞0.05)。MT