硼替佐米或聯(lián)合三氧化二砷逆轉(zhuǎn)HL60-ADR細(xì)胞耐藥及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 盡管急性白血病的治療效果近年來(lái)有了較明顯的提高,但仍然有15～30％的病人發(fā)生原發(fā)性耐藥,60～80％的患者完全緩解后因繼發(fā)性耐藥復(fù)發(fā)而死亡[1]。隨著生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解大部分是通過(guò)泛素-蛋白酶體通路(Ubiquitin-Protease Pathway,UPP)完成,人白血病細(xì)胞含有異常高水平的蛋白酶體活性,且在誘導(dǎo)終末白血病細(xì)胞分化時(shí)蛋白酶體迅速被下調(diào),表明蛋白酶體的活性與白

2、血病細(xì)胞的惡性增殖有著密切相關(guān)性,因此蛋白酶體可能成為白血病治療的新靶點(diǎn)[2]。
　　 目前研究證實(shí),蛋白酶體在細(xì)胞內(nèi)蛋白降解、MHC-Ⅰ類(lèi)抗原遞呈、細(xì)胞內(nèi)部錯(cuò)誤折疊蛋白的修復(fù)上發(fā)揮著重要的功能,多種與細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白的正常代謝,都與其功能的正確執(zhí)行密切相關(guān)。特異性阻斷蛋白酶體功能顯著改變以上蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝發(fā)生紊亂,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,是目前認(rèn)識(shí)的蛋白酶體抑制劑主要的抗腫

3、瘤作用機(jī)制[3]。
　　 硼替佐米(bortezomib)是第一個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床的蛋白酶體抑制劑,最開(kāi)始用于難治、復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)的治療[4]。后來(lái)多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明硼替佐米單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物治療非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、成人T細(xì)胞白血病、肺癌、卵巢癌等也具有良好效果[5]。有關(guān)硼替佐米治療耐藥急性髓系白血病的研究至今很少,我們前期工作中發(fā)現(xiàn)硼替佐米體外能夠抑制急

4、性髓系白血病細(xì)胞株HL60的增殖并誘導(dǎo)其凋亡,與三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合后作用明顯增強(qiáng)[6-9],但它們對(duì)多藥耐藥的急性髓系白血病細(xì)胞株HL60/ADR的作用如何,及其作用機(jī)制尚未清楚,此乃是本研究立題的主要?jiǎng)訖C(jī)。
　　 研究方法:
　　 選擇急性髓系白血病多藥耐藥細(xì)胞株HL60/ADR為研究對(duì)象。應(yīng)用MTT法比較HL60/ADR和HL60細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性,以耐藥倍數(shù)大于30倍定義為耐藥。加入非細(xì)胞毒濃度的硼替佐

5、米(細(xì)胞存活率大于95％)共同培養(yǎng)后,檢測(cè)HL60/ADR的阿霉素耐藥倍數(shù)變化。
　　 然后用MTT法確定硼替佐米和三氧化二砷的IC50值。將48小時(shí)IC50三氧化二砷(15n μM)與不同濃度(10～50nm)硼替佐米聯(lián)合處理HL60/ADR細(xì)胞,以空白處理組為對(duì)照,計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率并與三氧化二砷單藥組進(jìn)行比較,觀察三氧化二砷與不同濃度硼替佐米聯(lián)合的作用。
　　 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,得出與48h IC50三氧化二砷

6、有協(xié)同增殖抑制作用的硼替佐米劑量(10nM),將實(shí)驗(yàn)分為10nM和20nM硼替佐米單藥處理組、48h IC50三氧化二砷單藥處理組、10nM硼替佐米聯(lián)合48h IC50三氧化二砷處理組,以空白處理組為對(duì)照組。應(yīng)用Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡、AnnexinⅤ-EGFP/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL60/ADR細(xì)胞的阿霉素陽(yáng)性率、多藥耐藥相關(guān)蛋白1表達(dá)率,再用Western blot法檢測(cè)I κ

7、 B α、p65、bcl-2、bax、caspase-3、caspase-9、PARP蛋白的表達(dá),熒光定量RT-PCR檢測(cè)PDCD7、APP基因的表達(dá)。
　　 HL60/ADR細(xì)胞及HL60細(xì)胞的24小時(shí)阿霉素IC50值的比較,加硼替佐米與否HL60/ADR細(xì)胞的24小時(shí)阿霉素IC50值的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。不同時(shí)間、不同濃度硼替佐米組處理HL60/ADR細(xì)胞的增殖抑制率的比較用析因分析,48h IC50三氧化二砷和不同濃度硼

8、替佐米聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖抑制率與相同劑量硼替佐米單藥組的比較用兩樣本t檢驗(yàn)。不同時(shí)間、不同濃度硼替佐米單藥組或聯(lián)合三氧化二砷處理組的細(xì)胞凋亡率、多藥耐藥相關(guān)蛋白1表達(dá)的比較采用析因分析,同一時(shí)間不同實(shí)驗(yàn)組之間的比較采用單因素方差分析。硼替佐米、三氧化二砷單藥或聯(lián)合處理HL60/ADR細(xì)胞后阿霉素陽(yáng)性率的比較,各目的蛋白、目的基因表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較在方差齊性時(shí)采用LSD法,方差不齊時(shí)用Dunnett T3法,P<0

9、.05為差異具有顯著性水平。
　　 結(jié)論:
　　 1、硼替佐米能使HL60/ADR白血病細(xì)胞的耐藥倍數(shù)降低。
　　 2、硼替佐米單藥對(duì)HL60/ADR白血病細(xì)胞具有抑制增殖的作用,其效果呈時(shí)間-劑量依賴(lài)性。
　　 3、硼替佐米能夠誘導(dǎo)HL60/ADR白血病細(xì)胞凋亡,其作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加而增強(qiáng)。
　　 4、硼替佐米能夠提高HL60/ADR.白血病細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積量,隨著劑量增加作用增強(qiáng)

10、。
　　 5、硼替佐米與三氧化二砷聯(lián)合作用于HL60/ADR白血病細(xì)胞的上述效果均比兩者單藥處理時(shí)的作用效果顯著增加。
　　 6、硼替佐米能夠降低HL60/ADR白血病細(xì)胞的多藥耐藥相關(guān)蛋白1的表達(dá),其作用呈時(shí)間-劑量依賴(lài)性,與三氧化二砷聯(lián)合作用更明顯,這與其增加HL60/ADR細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥密切相關(guān)。
　　 7、硼替佐米能夠穩(wěn)定I-KB、抑制NF-κB活化,及抑制抗凋亡蛋白、增加促凋亡蛋白表達(dá)、