相關(guān)基因多態(tài)性與腎移植患者他克莫司個(gè)體化用藥的研究.pdf

1、據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)大約有100萬(wàn)名終末期腎病患者，并以每年50-100/100萬(wàn)的發(fā)生率在增長(zhǎng)，而腎移植是治療腎衰竭的最有效的方法，但發(fā)生排斥反應(yīng)是導(dǎo)致腎移植失敗的主要原因，因此免疫抑制劑能否合理應(yīng)用成為左右腎移植預(yù)后的關(guān)鍵。
　　 他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)是目前防治腎移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的一線免疫抑制劑，然而治療窗窄、藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大一直是困擾該藥臨床用藥的難題。目前臨床上雖然進(jìn)行常規(guī)的治療藥物監(jiān)測(cè)(th

2、erapeutic drug monitoring，TDM)，根據(jù)血藥濃度來(lái)調(diào)整用藥劑量，但其最大的弱點(diǎn)是滯后性，部分患者在監(jiān)測(cè)前就出現(xiàn)血藥濃度過(guò)低或過(guò)高導(dǎo)致的不良反應(yīng)，這對(duì)于移植術(shù)后初期的患者尤為危險(xiǎn)。因此找出他克莫司藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大的產(chǎn)生原因，實(shí)現(xiàn)他克莫司的個(gè)體化應(yīng)用，才是解決該問(wèn)題的關(guān)鍵。
　　 同時(shí)，他克莫司價(jià)格昂貴，終身服用給患者造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此也制約了它的使用，地爾硫卓常作為其節(jié)約劑在臨床上配伍使用，而我們

3、在臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)合用中藥護(hù)肝藥五酯片(每片含五味子酯甲7.5 mg)能顯著提高他克莫司濃度，有望成為新一代的節(jié)約劑。因此，如能從遺傳藥理學(xué)與合并用藥兩個(gè)方面考慮他克莫司的個(gè)體化用藥，以制定他克莫司的劑量預(yù)測(cè)方程，將有可能實(shí)現(xiàn)他克莫司安全、有效、經(jīng)濟(jì)的個(gè)體化用藥。目前國(guó)內(nèi)外仍未有類似的報(bào)道。
　　 多年的研究表明20％～95％的藥物反應(yīng)和處置的個(gè)體差異是由遺傳因素引起的。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)他克莫司的個(gè)體化用藥研究主要集中在藥物代謝酶

4、(CYP3A4、3A5)及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(P-gp，由MDR1基因編碼)的遺傳多態(tài)性上，然而目前結(jié)論比較一致的只有CYP3A5*3與他克莫司濃度密切相關(guān)。雖然CYP3A4*1B也被證明與他克莫司藥動(dòng)學(xué)相關(guān)，但是中國(guó)人群中并未發(fā)現(xiàn)該突變，因此該突變不可能是造成中國(guó)人他克莫司藥動(dòng)學(xué)差異大的主要原因。而MDR1基因多態(tài)性的影響則仍無(wú)定論。CYP3A4*1G是新近發(fā)現(xiàn)的在中國(guó)人群CYP3A4基因中發(fā)生頻率最高的單核苷酸多態(tài)性(single nucle

5、otide polymorphism，SNP)，國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)其與CYP3A4酶活性升高相關(guān)，因此該位點(diǎn)也可能與他克莫司藥動(dòng)學(xué)相關(guān)。
　　 此外，近年來(lái)，核受體作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)調(diào)控中所起的重要作用逐漸被認(rèn)識(shí)。其中，孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR，由NR1I2基因編碼)被發(fā)現(xiàn)能同時(shí)調(diào)控CYP3A4/3A5、MDR1的表達(dá)。因此NR1I2的基因多態(tài)性也可能通過(guò)影響CYP3

6、A4/3A5、MDR1的表達(dá)從而間接影響他克莫司的藥動(dòng)學(xué)。
　　 目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)CYP3A4、CYP3A5、MDR1的基因多態(tài)性的特點(diǎn)和發(fā)生頻率的研究較為系統(tǒng)，在不同種族都有較為詳盡的報(bào)道。但對(duì)于NR1I2基因多態(tài)性目前只有針對(duì)非裔美國(guó)人和高加索人的研究資料，無(wú)完善的亞洲人/中國(guó)人的相關(guān)研究，而且從目前的研究結(jié)果可知NR1I2的突變種族差異極大。
　　 綜上，本課題將首先對(duì)中國(guó)健康人群NR1I2基因的SNP進(jìn)行篩查，并對(duì)

7、位于關(guān)鍵區(qū)域的SNP進(jìn)行功能研究，隨后將根據(jù)文獻(xiàn)與本課題前期研究結(jié)果確定在腎移植患者中各個(gè)基因待研究的位點(diǎn)，通過(guò)回顧性研究綜合分析CYP3A4、CYP3A5、MDR1、NR1I2的基因多態(tài)性及合并用藥(地爾硫卓、五酯片)與他克莫司濃度的關(guān)系，篩選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素，建立劑量預(yù)測(cè)方程，并通過(guò)臨床應(yīng)用進(jìn)行驗(yàn)證，希望能在首次給藥前制訂出最適合該患者的給藥方案，使血藥濃度盡早達(dá)到治療窗，從而降低患者由于多次劑量調(diào)整導(dǎo)致濃度波動(dòng)而產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)

8、，實(shí)現(xiàn)他克莫司的個(gè)體化應(yīng)用。
　　 第一部分PXR/NR1I2基因多態(tài)性研究
　　 目的：
　　 研究中國(guó)健康漢族人PXR/NR1I2的基因多態(tài)性，并對(duì)位于關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域的SNP進(jìn)行功能研究。
　　 方法：
　　 采用PCR-直接測(cè)序法，對(duì)NR1I2基因的5'UTR、3'UTR、各外顯子及近端內(nèi)含子的已知與未知的SNP進(jìn)行篩查i采用報(bào)告基因的方法檢測(cè)兩個(gè)位于啟動(dòng)子關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域的SNP的功能。

9、　　 結(jié)論：
　　 中國(guó)健康漢族人群的NR1I2基因中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)SNP，其中位于NR1I2基因啟動(dòng)子關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域的A-24622T與C-24446A能使自身轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)。中國(guó)健康漢族人群NR1I2的SNP的種類及發(fā)生頻率與高加索人及非裔美國(guó)人存在顯著的種族差異。
　　 第二部分全血中他克莫司的LC/MS/MS分析方法的建立與腎移植患者藥動(dòng)學(xué)研究
　　 目的：
　　 建立并驗(yàn)證他克莫司的質(zhì)譜檢測(cè)方法，并

10、應(yīng)用于腎移植患者藥動(dòng)學(xué)研究中。
　　 方法：
　　 1.建立他克莫司檢測(cè)的質(zhì)譜方法、液相方法及全血樣本的萃取方法。
　　 2.進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證：包括方法的精密度、準(zhǔn)確度、線性及最低檢測(cè)限、穩(wěn)定性及基質(zhì)效應(yīng)等。
　　 3.研究地爾硫卓對(duì)他克莫司藥動(dòng)學(xué)的影響。
　　 結(jié)論：
　　 建立了LC/MS/MS分析方法檢測(cè)人全血中他克莫司濃度，該方法靈敏、特異、可靠、快速，并成功應(yīng)用于他克莫司-地

11、爾硫卓藥物相互作用試驗(yàn)。合用地爾硫卓可以提高他克莫司的濃度，并且C0與AUC0-12 h的相關(guān)性仍較好。
　　 第三部分相關(guān)基因多態(tài)性及地爾硫卓與早期腎移植患者他克莫司濃度的相關(guān)性研究
　　 目的：
　　 回顧性研究遺傳因素(CYP3A4、CYP3A5、MDR1及NR1I2基因多態(tài)性)及地爾硫卓對(duì)他克莫司濃度的影響，為實(shí)現(xiàn)他克莫司的個(gè)體化給藥提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 采用PCR-RFLP法檢

12、測(cè)CYP3A4、CYP3A5及MDR1基因多態(tài)性，采用PCR-直接測(cè)序法檢測(cè)NR1 I2基因多態(tài)性，術(shù)后第七天全血谷濃度(C0)為臨床TDM數(shù)據(jù)，分析各基因型及地爾硫卓與他克莫司濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 CYP3A5*3基因型與他克莫司濃度密切相關(guān)，且CYP3A5與CYP3A4、MDR1、NR1I2之間存在基因型相互作用。地爾硫卓能顯著提高他克莫司濃度，影響程度受CYP3A5*3基因型影響?？筛鶕?jù)CYP3A5*

13、3及地爾硫卓構(gòu)建他克莫司劑量預(yù)測(cè)方程。
　　 第四部分五酯片對(duì)CYP3A5表達(dá)型患者他克莫司藥動(dòng)學(xué)的影響
　　 目的：
　　 本部分研究將以CYP3A5表達(dá)型患者作為研究對(duì)象，以地爾硫卓作為陽(yáng)性對(duì)照，比較五酯片和地爾硫卓對(duì)他克莫司藥動(dòng)學(xué)的影響情況。
　　 方法：
　　 1.24例經(jīng)鑒定為CYP3A5表達(dá)型的腎移植患者在服用他克莫司至兩周待血藥濃度到達(dá)穩(wěn)態(tài)后隨機(jī)分為地爾硫卓組與五酯片組，每組各12例

14、。
　　 2.在試驗(yàn)第1天，在給他克莫司前(0 h)和給藥后0.5，1，1.5，2，3，4，6，9，12 h取血。之后合用地爾硫卓(30 mg，每天三次)或者五酯片(0.54 g，每天三次)，合用兩周后(即試驗(yàn)第15天)進(jìn)行第二次取血，取血時(shí)間點(diǎn)同試驗(yàn)第1天取血。全血中他克莫司濃度采用LC/MS/MS法檢測(cè)。
　　 結(jié)論：
　　 五酯片能顯著影響CYP3A5表達(dá)型患者他克莫司的藥動(dòng)學(xué)，降低他克莫司的用量，且五酯片

15、的作用較地爾硫卓更顯著。合用五酯片時(shí)他克莫司C0與AUC0-12 h相關(guān)性仍較好。
　　 第五部分CYP3A5*3基因型聯(lián)合地爾硫卓/五酯片干預(yù)他克莫司用藥的前瞻性研究
　　 目的：
　　 通過(guò)前瞻性研究，驗(yàn)證結(jié)合CYP3A5*3基因型及地爾硫卓/五酯片預(yù)測(cè)劑量的他克莫司給藥方案。
　　 方法：
　　 1.試驗(yàn)分組
　　 (1)地爾硫卓組
　　 腎移植患者術(shù)前進(jìn)行CYP3A5*3基

16、因型檢測(cè)，CYP3A5表達(dá)型與非表達(dá)型患者各16例，隨機(jī)分入試驗(yàn)組與對(duì)照組，試驗(yàn)組與對(duì)照組各含CYP3A5表達(dá)型及非表達(dá)型患者各8例。試驗(yàn)組合用地爾硫卓，采用方程預(yù)測(cè)劑量給藥；對(duì)照組不合用地爾硫卓，采用常規(guī)劑量給藥(0.05-0.075 mg/kg，bid)。
　　 (2)五酯片組
　　 腎移植患者術(shù)前進(jìn)行CYP3A5*3基因型檢測(cè)，32例CYP3A5表達(dá)型患者隨機(jī)分為試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組各16例。試驗(yàn)組合用五酯片，他克

17、莫司每次劑量為臨床最低劑量0.05 mg/kgi對(duì)照組采用常規(guī)劑量給藥。
　　 2.評(píng)價(jià)指標(biāo)：
　　 他克莫司起始劑量(僅五酯片組)、首劑他克莫司穩(wěn)態(tài)谷濃度、首劑穩(wěn)態(tài)谷濃度超出治療窗的比例、達(dá)治療窗前劑量調(diào)整次數(shù)、達(dá)治療窗時(shí)他克莫司所需劑量、術(shù)后兩周內(nèi)的急性排斥發(fā)生率及術(shù)后兩周(第14天)的血肌酐水平。
　　 結(jié)論：
　　 對(duì)于CYP3A5表達(dá)型患者，地爾硫卓方案和五酯片方案均能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)他克莫司的給藥