齊整小核菌木質(zhì)纖維素降解能力及硬葡聚糖合成途徑的研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素生物質(zhì)可混合糖發(fā)酵為生物能或其它類型的生物材料，一直以來(lái)都被認(rèn)為是一種潛在的可持續(xù)利用的資源。但目前該資源仍未被充分利用，究其原因，主要在于該生物質(zhì)難于降解和轉(zhuǎn)化。
　　絲狀真菌齊整小核菌Sclerotium rolfsii作為白腐菌，在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它具有很強(qiáng)的木質(zhì)纖維素降解能力，可直接利用生物質(zhì)，具有高價(jià)值化木質(zhì)纖維素資源的迷人前景。同時(shí)它也是一種用來(lái)生產(chǎn)硬葡聚糖的載體微生物，可高效實(shí)施生物煉制。硬葡聚糖是一種價(jià)值很

2、高的多糖聚合物，是生物煉制的絕佳產(chǎn)物，具有廣泛用途，如工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、食品加工等，現(xiàn)已迅速崛起成為一種重要的有應(yīng)用前景的的工業(yè)資源。但對(duì) Sclerotium rolfsii 生物合成機(jī)制并不了解，本研究為Sclerotium rolfsii硬葡聚糖高效產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)提供理論基礎(chǔ)。
　　Sclerotium rolfsii木質(zhì)纖維素降解能力的研究。
　　1. 通過(guò)前期系列比對(duì)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sclerotium rolfsii具有強(qiáng)大

3、的降解木質(zhì)纖維素的能力，基于此，我們對(duì) Sclerotium rolfsii 做全基因組測(cè)序。根據(jù)基因組結(jié)果對(duì)Sclerotium rolfsii做了進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)該菌與黃孢原毛平革菌等多種木質(zhì)纖維素強(qiáng)降解菌株具有近緣關(guān)系。對(duì)木質(zhì)纖維素降解酶相關(guān)基因進(jìn)行分析注釋，得知該菌含有碳水化合物酶基因 1558 個(gè)，含有木質(zhì)素降解酶相關(guān)基因 21 個(gè)，這兩個(gè)數(shù)值遠(yuǎn)高于或相近于相應(yīng)基因在有些已報(bào)道的相關(guān)降解菌中的個(gè)數(shù) (如木質(zhì)纖維素降解模式菌Di

4、chomitus squalens含有碳水化合物酶基因391個(gè)，木質(zhì)素降解酶相關(guān)基因12個(gè))。
　　2. 做大量比對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Sclerotium rolfsii強(qiáng)降解木質(zhì)纖維素能力。主要與其它已報(bào)道的木質(zhì)纖維素降解菌對(duì)比(Tv: Trametes versicolor, Ds: Dichomitus squalens, Tr:Trichoderma reesei)。通過(guò)這些白腐菌對(duì)三種典型生物質(zhì)底物（濾紙、堿性木質(zhì)素及小麥秸

5、稈）的降解，得出現(xiàn)象：20 天處理后，各菌對(duì)濾紙均有不同程度的降解，其中Sclerotium rolfsii培養(yǎng)基中濾紙?zhí)Ч顬槊黠@，該菌對(duì)濾紙降解效率高達(dá)65％，纖維素酶活約2500U/g；20天處理后，Sclerotium rolfsii對(duì)堿木質(zhì)素降解率可達(dá) 38%；30 天處理后的小麥秸稈被各菌不同程度的的分解， Sclerotium rolfsii 對(duì)小麥秸稈的降解效果比木質(zhì)纖維素強(qiáng)降解白腐菌 Trametes versic

6、olor 更明顯，半纖維素，纖維素和木質(zhì)素各成分與對(duì)照相比都有不同程度的減少，其中纖維素量減少尤為明顯。同樣監(jiān)測(cè)各培養(yǎng)基中纖維素酶活性，Sclerotium rolfsii纖維素酶活性最高。這些現(xiàn)象充分證明齊整小核菌具有高效降解木質(zhì)纖維素的能力，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為高效降解木質(zhì)纖維素菌株提供新的可能性，對(duì)深入探究Sclerotium rolfsii降解木質(zhì)纖維素機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　Sclerotium rolfsii 硬葡聚糖生物合

7、成途徑研究。
　　1.基于文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于Sclerotium rolfsii合成硬葡聚糖假想代謝通路圖，注釋出該通路中所有相關(guān)酶基因，重點(diǎn)分析合成代謝途徑中第五步關(guān)鍵酶基因。
　　2.穩(wěn)定兩種不同產(chǎn)硬葡聚糖體系（高產(chǎn)糖及低產(chǎn)糖），并分別做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找出兩種產(chǎn)糖條件下的差異顯著基因并做差異基因GO富集分析及KEGG富集分析，結(jié)果表明在高產(chǎn)硬葡聚糖條件下，與多糖結(jié)合位點(diǎn)、堿基化合物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因明顯富集。分析硬葡聚糖合成假想通路圖

8、中所有關(guān)鍵酶基因在兩種產(chǎn)糖條件下mRNA表達(dá)差異，得出高產(chǎn)糖條件下，該通路中大部分相關(guān)酶基因均上調(diào)。
　　3.基于Sclerotium rolfsii轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報(bào)道挑出16個(gè)候選內(nèi)參基因，在8種不同脅迫條件下（pH、溫度、碳氮源及碳氮比）對(duì)這些候選基因進(jìn)行 qRT-PCR定量，并用四個(gè)評(píng)估程序?qū)Χ拷Y(jié)果進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，綜合分析四種評(píng)估結(jié)果，最終篩選出三個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因DUF、HYP與β-TUB,其中前兩個(gè)基因是基于轉(zhuǎn)錄組

9、結(jié)果篩選出新的內(nèi)參基因。為驗(yàn)證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取兩個(gè)靶基因ZinP及DimL，以DUF、HYP及β-TUB為內(nèi)參基因，在高產(chǎn)及低產(chǎn)糖條件下對(duì)這兩個(gè)靶基因進(jìn)行qRT-PCR相對(duì)定量，其定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄結(jié)果完全一致，充分驗(yàn)證了篩選結(jié)果的可行性。本次實(shí)驗(yàn)首次為S. rolfsii挑選合適內(nèi)參基因，為該菌后續(xù)的基因水平定量提供有力保障，同時(shí)也為其它白腐菌內(nèi)參基因的選擇提供了參考。
　　4. Sclerotium rolfsii硬葡聚糖生