木質(zhì)纖維素優(yōu)勢降解菌株的酶學(xué)特性及其產(chǎn)物研究.pdf

1、纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶是木質(zhì)纖維素資源高效轉(zhuǎn)化利用的關(guān)鍵酶，其活力和成本是生物煉制技術(shù)發(fā)展的主要瓶頸。同時木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品還存在非糧木質(zhì)纖維素原料的選育困難、預(yù)處理復(fù)雜等技術(shù)瓶頸。目前能源危機(jī)、環(huán)境污染和糧食緊張三方面問題給社會的可持續(xù)發(fā)展帶來了許多的困難，人們的目光聚焦到了生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)有效而又環(huán)境友好的生物燃料和其他高附加值產(chǎn)品上，其中高效降解木質(zhì)纖維素的微生物及其酶系正成為研究關(guān)注的焦點。
　　為了尋找新型生物

2、質(zhì)能源植物和高效降解纖維素的細(xì)菌，本文利用課題組前期從垃圾填埋場和泥炭中篩選得到的纖維素降解菌株，水解纖維素植物美洲龍舌蘭。通過龍舌蘭-瓊脂平板法定性分析18株細(xì)菌的纖維素內(nèi)切酶活力，篩選出了降解龍舌蘭的優(yōu)勢菌種:55S2（杜搟氏菌），65S3（芽孢桿菌）和CDS3（假單胞桿菌）。使用乙醇分析測定試劑盒和高效液相法(HPLC)測定其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌65S3和假單胞桿菌CDS3降解龍舌蘭生產(chǎn)生物乙醇和木糖醇的性能優(yōu)越于其他16株細(xì)菌

3、。芽孢桿菌屬菌株(65S3)降解龍舌蘭生產(chǎn)生物乙醇最高產(chǎn)率為0.92g/g。而假單胞菌屬菌株(CDS3)降解龍舌蘭生產(chǎn)生物木糖醇最高產(chǎn)率為0.98g/g。利用掃描電子顯微鏡觀察3株細(xì)菌降解龍舌蘭的形態(tài)學(xué)都有不同程度的改變。因此龍舌蘭是一種生產(chǎn)生物乙醇和木糖醇的理想原料，芽孢桿菌65S3和假單胞桿菌CDS3能夠生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，在生物煉制行業(yè)具有巨大潛力。
　　自然界中參與降解木質(zhì)纖維素材料的微生物除細(xì)菌外，真菌也具有很強(qiáng)的木質(zhì)纖維

4、素分解能力，尤其是木霉屬中的里氏木霉（Trichoderma reesei）產(chǎn)生的纖維素酶各組分最為齊全。為提高里氏木霉降解木質(zhì)纖維素的能力，提高木質(zhì)纖維素酶的表達(dá)量，課題組前期以QM9414為宿主菌，成功導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因Ace2,得到工程菌T/Ace2-2,T/Ace2-5,T/Ace2-8,T/Ace5-4和T/Ace10-1。本文對這5個工程菌的酶活進(jìn)行了全面研究，結(jié)果顯示T/Ace2-2總濾紙酶酶活的最大值比宿主菌QM941

5、4最大酶活力增加了2倍，并且第6天木聚糖酶酶活為其宿主菌的1.12倍。利用HPLC法研究工程菌T/Ace2-2降解樹皮生成木糖醇的產(chǎn)率，將T/Ace2-2接種于木糖-MA培養(yǎng)基第6天時，樹皮被轉(zhuǎn)化為木糖醇的產(chǎn)率最大為0.12g/g。使用掃描電子顯微鏡觀察可見工程菌T/Ace2-2降解樹皮的形態(tài)也發(fā)生了顯著變化。因此，里氏木霉工程菌T/Ace2-2能高效降解未經(jīng)預(yù)處理的樹皮等木質(zhì)纖維素，為實現(xiàn)了木糖醇產(chǎn)業(yè)的清潔化生產(chǎn)和生產(chǎn)成本的下降提供了

6、有用的實驗數(shù)據(jù)。
　　為賦予里氏木霉降解木質(zhì)素的能力，課題組前期以QM9414為宿主菌，成功異源表達(dá)了木質(zhì)素過氧化物酶基因lipH8,得到了工程菌T/Lip4-3,T/Lip8-5和T/Lip10-7。本文通過對工程菌T/LiP4-3,T/LiP8-5和T/LiP10-7的木質(zhì)素過氧化物酶酶活的研究，證實了工程菌T/LiP10-7第15天過氧化物酶酶活力達(dá)最高值64.47IU/ml，進(jìn)而用液相色譜-質(zhì)普聯(lián)用儀(LC-MS)對工程菌

7、T/LiP10-7降解木屑的產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物有乙酰丙酸和苯等，掃描電鏡實驗也說明經(jīng)過工程菌T/LiP10-7降解后木屑內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。故里氏木霉工程菌T/LiP10-7可用于降解木屑等木質(zhì)纖維素，生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。
　　為研究里氏木霉纖維素酶和木聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳改造方向，我們對里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶EGⅣ和木聚糖酶xyn1、xyn2氨基酸序列進(jìn)行了特征分析，使用Discovery studio對EGⅣ進(jìn)行

8、了同源模建，并通過Line Plot圖和Profiles-3D方法對預(yù)測的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了評估，結(jié)果表明預(yù)測結(jié)果合理。通過Molegro Virtual Docker(MVD)軟件對EGⅣ和xyn1、xyn2進(jìn)行對接實驗，并對得到的配體與酶的結(jié)合位點進(jìn)行了保守性分析，結(jié)果表明xyn1與木二糖配體存在6個高度保守位點:Glu75、Asp33、Met79、Phe121、Glu164和Trp166。Xyn2也存在類似的結(jié)果，但整體保守性程度要高于x

9、yn1,高度保守位點分別是:Phe45、Val46、Trp79、Arg122、Asn44、Glu86、Tyr88和Glu177。對里氏木霉纖維素酶EGⅣ進(jìn)行分子對接，我們共獲得22個與纖維二糖配體結(jié)合的位點，其中有17個位點是高度保守位點:His1、Gly2、His3、Pro20、Trp34、Ala36、Gly42、Va144、Ser45、Ala48、His57、Lys58、Asn169、Ala171、Tyr174、Pro175和Cys