降解纖維素菌種篩選及纖維素降解研究.pdf

1、利用纖維素的最佳方法是微生物降解轉化，鑒于目前纖維素降解菌株酶活力低、纖維素酶誘導產(chǎn)酶及纖維素降解機理不完全清楚等限制纖維素資源有效利用的情況下，為了有效利用纖維素這種可再生能源，篩選高效降解菌，研究菌株產(chǎn)酶機制以及纖維素降解機理仍然具有重要的理論和實踐意義。
　　本文從57份土樣中，通過分離純化得到97株菌株。對其進行剛果紅鑒別培養(yǎng)基和濾紙條液體培養(yǎng)法初篩，并結合復篩得到2株纖維素酶活較高的菌株。經(jīng)形態(tài)學鑒定H-11為簡青霉（P

2、enicillium simplicissimum），C-08為綠色木霉（Trichoderma viride）。
　　研究了幾種影響二菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的因素，液體發(fā)酵結果表明：麩皮和稻草為適合碳源，兩者比例H-11為4:3，C-08為5:2；最適有機氮源為豆餅粉，而無機氮源分別是KNO3和(NH4)2SO4。H-11產(chǎn)酶最適為豆餅粉，而C-08產(chǎn)酶的(NH4)2SO4:豆餅粉比例為1:5。最適產(chǎn)酶碳源和氮源比例，H-11為7:1，C

3、-08為5:1；最適百分含量，都為3.6％；最適產(chǎn)酶pH，H-11為3.6，C-08為3.2；最適溫度都為30℃；最適產(chǎn)酶時間H-11為144h，C-08為96h。
　　固態(tài)發(fā)酵結果表明：秸稈粉和麩皮為2∶4最適合產(chǎn)酶；尿素和氨態(tài)氮適合H-11產(chǎn)酶。氨態(tài)氮適合C-08產(chǎn)CMCase，NO3-利于產(chǎn)Xylanase，其中NH4NO3最好；料水比1∶1比較適合H-11產(chǎn)CMCase，1∶1.5適合產(chǎn)Xylanase。料水比1∶2適合C

4、-08產(chǎn)CMCase，1∶2.5適合產(chǎn)Xylanase；H-11隨底物粒度的降低CMCase增加，在60～100目時產(chǎn)Xylanase最低。稻草粉粒度40～100目時，適合C-08產(chǎn)CMCase，此范圍外適合產(chǎn)Xylanase；初始pH為3和4時則適合H-11菌株產(chǎn)CMCase和Xylanase。pH值為4適合C-08產(chǎn)酶；孢子接種量為7～8×107孢子/mL時適合兩株菌產(chǎn)酶；28℃適合H-11產(chǎn)酶，在低于28℃時適合C-08產(chǎn)酶；發(fā)酵

5、時間H-11為60h，C-08為72h。
　　固定化研究表明，制備小球的最適海藻酸鈉溶液濃度為5%。麩皮汁較適合菌株產(chǎn)酶，H-11比C-08產(chǎn)酶能力強。菌株間親和性不強。H-11則在pH為3和4時，更適合產(chǎn)CMCase和Xylanase，C-08產(chǎn)酶適宜pH為7。固定化細胞產(chǎn)酶能力強于游離細胞。Tween-80有利于提高菌株的產(chǎn)酶活力。
　　利用液體培養(yǎng)和洗滌菌絲誘導培養(yǎng)法研究了碳源對菌株的誘導特性。結果發(fā)現(xiàn)D-甘露糖對H-

6、11有較好的誘導作用，葡萄糖對C-08有較好的產(chǎn)酶作用。葡萄糖促使H-11、C-08產(chǎn)生FPase、CMCase、C1和β-Gase，各種酶產(chǎn)量在菌株間及菌株內差別很大。
　　制備細胞外、細胞壁膜、細胞內纖維素酶，并用其分別轉化纖維二糖，對轉化產(chǎn)物高效液相色譜定性分析，從而探討碳源的誘導本質。結果顯示：H-11胞內酶和C-08的胞外酶的轉化產(chǎn)物，除產(chǎn)生葡萄糖外，亦產(chǎn)生一種未知的物質A。胞壁膜酶無轉化作用。H-11的胞外酶和C-08

7、的胞內酶液對纖維二糖除水解外亦有轉化作用。從而證明纖維二糖不是菌株的誘導物。
　　將H-11液體發(fā)酵粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、柱層析后得到電泳純的β-GaseⅠ、β-GaseⅡ和CMCase組分。對純組分的理化性質研究表明：三組分的分子量分別為126.0KDa、77.8KDa和33.2kDa；最適溫度都為60℃，分別在40℃、40℃和50℃以下穩(wěn)定；最適pH值為pH4.4～5.2、3.6～4.0和2.8，在pH值4.4～6.8、2.

8、8～6.8和2.8～6.8范圍內穩(wěn)定。Mn2+、Ca2+、Sn2+和Li+對β-GaseⅠ有促進作用，Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Fe3+對β-GaseⅠ有抑制作用；Mn2+、Sn2+和Fe2+對β-GaseⅡ有促進作用，Zn2+、Cu2+、Co2+和Fe3+對β-GaseⅡ有抑制作用；Sn2+對CMCase酶活力有明顯的增強作用，Mn2+和Cu2+對酶有顯著的抑制作用。β-GaseⅠ水解水楊素的Km和Vmax值分

9、別622.306mg·mL-1和15.480mg·mL-1·min-1，β-GaseⅡ水解水楊素的Km和Vmax值分別26.689mg·mL-1和0.508mg·mL-1·min-1，CMCase作用于CMC-Na的動力學參數(shù)Km和Vmax值分別1.744mg·mL-1和14.124mg·mL-1·min-1。三種酶的底物特異性較差，β-GaseⅠ、β-GaseⅡ不以CMC-Na為底物，CMCase不作用于水楊素，除此之外，三組分對MC

10、C、濾紙、幾丁質、pNPC和pNPG都有作用。
　　通過對三組分的紅外圖譜特征頻率區(qū)進行分析，結果表明其蛋白質二級結構都主要以α-螺旋形式存在。
　　H-11的粗酶液中C1、CMCase對MCC都具有吸附-解吸附作用，而β-Gase對MCC不具有吸附-解吸附作用，三種純組分和C-08粗酶液中的C1、CMCase、β-Gase對MCC都具有吸附-解吸附作用。
　　β-GaseⅠ和β-GaseⅡ對CMCase降解纖維素有很