Gytophaga hutchinsonii纖維素降解機制的研究.pdf

1、以纖維素為主要成分的植物生物質是地球上最豐富的可再生資源。隨著石油、煤炭等化石資源的逐漸枯竭，開發(fā)新的可再生能源已經成為人們迫切的需求，因此對木質纖維素的高效開發(fā)利用越來越受到人們的重視。但由于纖維素自身的特殊性質和目前人們對已知纖維素降解微生物和降解酶認識的不足，只有很少一部分纖維素資源被有效的利用。
　　 自然界中可降解纖維素的微生物多種多樣，其降解纖維素的策略也呈現(xiàn)多樣性。其中好氧細菌Cytophaga hutchinso

2、nii表現(xiàn)出很強的結晶纖維素降解能力，但其纖維素降解機制尚不明確。該菌可能利用一種既與已知的非復合體型纖維素酶酶系模式，又與復合型纖維小體模式不同的獨特纖維素降解機制以實現(xiàn)纖維素的高效降解。因此本文展開了對C.hutchinsonii降解纖維素機理的研究，主要研究了該菌對不同碳源的利用情況，并從生化和遺傳角度對其細胞膜相關主要纖維素酶進行了研究，由此提出了該菌降解纖維素的機理模型。本文的主要內容及結果如下：
　　 1.對C.hu

3、tchinsonii在不同碳源中的生長、底物消耗與產物形成進行了系統(tǒng)分析，并研究了纖維素酶在細胞中的分布。
　　 研究發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii在結晶纖維素和無定形纖維素中生長時，纖維素的利用率和生物量得率都相近；首次在以纖維素為唯一碳源的C.hutchinsonii培養(yǎng)液上清中檢測到了少量葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖；同時，研究表明所獲得的C.hutchinsonii休止細胞具有酶解結晶纖維素產生纖維寡糖的能力，而且對纖維

4、寡糖也具有很好的水解能力。纖維二糖可以誘導促進C.hutchinsonii纖維二糖和纖維寡糖的利用，使菌體生長延滯期縮短。在建立了C.hutchinsoni細胞分級分離技術的基礎上，對纖維素酶的細胞空間分布進行了分析，結果表明結晶纖維素能夠顯著誘導C.hutchinsonii細胞外膜羧甲基纖維素酶的酶活水平，而纖維二糖則能誘導細胞質膜中纖維二糖酶的活力水平。
　　 2.建立了熒光輔助糖電泳(FACE)技術，并成功地應用于C.hu

5、tchinsonii纖維素降解機理的研究。
　　 發(fā)現(xiàn)FACE分離膠濃度高于32％時纖維寡糖可以有效分離；同時發(fā)現(xiàn)ANTS標記具有較好的溫度穩(wěn)定性，并且可以對纖維素材料如Avicel，RAC和Filterpaper等進行標記。因此該技術可以用來分析纖維素酶對纖維素和纖維寡糖的降解產物，并且可以分析纖維素酶對纖維寡糖催化的糖苷鍵位置。
　　 3.建立了C.hutchinsoni膜相關蛋白提取分離技術，并在此基礎上初步建立了

6、用于檢測C.hutchinsoni膜蛋白復合物的Blue Native-PAGE技術。
　　 在細胞分級分離的基礎上，通過對各種去垢劑的膜蛋白溶解效率及酶活保持能力的分析，確定了基于n-dodecyl-β-D-maltoside(DDM)的細胞膜相關蛋白提取的技術；并進一步建立了用于檢測C.hutchinsoni膜蛋白復合物的BlueNative-PAGE技術，該技術可以保持膜蛋白復合物的活性，并且通過與質譜技術的聯(lián)用可以鑒定復

7、合物的成分。
　　 4.首次從C.hutchinsoni細胞外膜蛋白中分離純化到了三個纖維素酶組分，并對其性質進行了研究。
　　 C.hutchinsonii細胞外膜蛋白分別經過DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephacryl S-100 HR凝膠過濾層析分離后，獲得三個純化的纖維素酶組份。經質譜鑒定其分別為CHU_1107，CH

8、U_1075和CHU_3384，蛋白分子量分別為136.2 kDa，274.8 kDa和33.8kDa。三種酶對羧甲基纖維素(CMC)反應的最適pH都為5.0，最適溫度分別為45℃，40℃和45℃；底物分析結果表明，除CMC外，三種酶還可以降解地衣多糖(Lichenan)和木聚糖(Xylan)；同時三種酶對纖維寡糖都有一定降解活性。此外，CHU_1107對再生無定形纖維素(RAC)具有降解活性，而CHU_1075對幾丁質(Chitin)

9、有一定的降解活力。去垢劑DDM和TritonX-100對CHU_1107的酶活力有明顯的促進作用。
　　 5.在大腸桿菌中表達純化了CHU_1107和CHU_1075的催化結構域，并對CHU_1107催化結構域(CHU_1107 GH5)的催化特性和催化中心關鍵氨基酸進行了研究。
　　 純化獲得的CHU_1107催化結構域(CHU_1107GH5)對CMC，Lichenan，聚合度大于2的纖維寡糖(Cellodextri

10、ns DP>2)，RAC，濾紙和結晶纖維素AvicelPH-101都具有降解活性，水解產物以纖維二糖為主；瑞氏木霉CBH I來源的CBM結構域對CHU_1107GH5降解結晶纖維素的能力具有一定促進作用。在以Avicel PH-101進行的水解反應中，CHU_1107GH5可以使Avicel結晶度降低但保持平均聚合度不變，表現(xiàn)出一定的持續(xù)性催化特性。進化分析顯示其與Saccharophagus degradans持續(xù)性催化內切酶Cel5

11、H具有很高的同源性。通過對CHU_1107GH5催化中心保守氨基酸His131，His225和E166N的定點突變分析表明，所有突變體均喪失了相關水解活性，而催化中心周圍的芳香族氨基酸Trp61和Trp308可能在酶與結晶纖維素底物結合過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 6.初步建立了包括轉座子隨機誘變和基因插入失活的C.hutchinsonii遺傳操作體系，并首次在C.hutchinsonii中實現(xiàn)了基因的插入失活。
　　

12、通過接合轉移，以轉座子pHimarEml對C.hutchinsonii基因組進行隨機插入誘變，實現(xiàn)了外源DNA向C.hutchinsonii的轉移，并由此建立了一個小型轉座子突變體庫，篩選獲得了一些菌落擴散能力增強的突變株。以pHimarEml為攜帶載體，實現(xiàn)了來自Flavobacterium johnsoniae的PompA啟動子控制的綠色熒光蛋白(GFP)在C.hutchinsonii體內的活性表達。進一步利用自殺型質粒pLYL03