吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對(duì)2型糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用.pdf

1、目的:糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DC)是糖尿病性心臟病的特異性病變。已有較多證據(jù)表明,部分糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者出現(xiàn)的心力衰竭與大血管的粥樣硬化無(wú)關(guān),而是由糖尿病心肌病所致。早期因無(wú)癥狀或癥狀不典型,DC的診斷和治療常被忽視。因此,闡明DC的發(fā)病機(jī)制,早期干預(yù)延緩DC的發(fā)生發(fā)展,對(duì)降低DM患者死亡率有重要意義。目前,糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,涉及代謝紊亂、組織結(jié)

2、構(gòu)異常、局部病理生理改變等多個(gè)方面。近年有學(xué)者提出“氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)”,認(rèn)為高糖作用于心肌線粒體,激活活性氧簇,由于活性氧的過(guò)度生成使細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)不能完全消除有毒自由基或失去其防御功能,導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡,誘生型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)表達(dá)增多,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的一氧化氮(NO),活化的炎細(xì)胞釋放超氧陰離子(O-.2)。NO可與O-.2迅速結(jié)合生成氧化作用更強(qiáng)的過(guò)氧化亞硝酸陰

3、離子(ONOO-),ONOO-可使蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝基化反應(yīng),形成最終產(chǎn)物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)。蛋白質(zhì)的硝基化可導(dǎo)致酶活性的喪失、細(xì)胞的壞死和凋亡,從而參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程。
　　 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)為二硫氨基酸酯,因其分子所含巰基(thiol)結(jié)構(gòu),具有抗氧化及金屬螯合作用?？梢蕴禺愋砸种坪宿D(zhuǎn)錄因子-

4、κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活性,有效抑制氧化損傷過(guò)程中因NF-κB活性增高引起的多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)。已有多項(xiàng)研究表明,PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平。本研究以高脂喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射建立的2型糖尿病大鼠模型為研究對(duì)象,觀察氧化應(yīng)激對(duì)糖尿病心肌病發(fā)生的影響及PDTC對(duì)糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用。為開發(fā)防治糖尿病及其并發(fā)癥的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法

5、:
　　 參照Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型。健康8周齡雄性Wistar大鼠37只,體重180-210g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)12只和高脂飲食組(HFD組)25只,NC組喂以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料,HFD組喂以高脂飼料,喂養(yǎng)8周后行口服葡萄糖耐量試驗(yàn),HFD組證實(shí)出現(xiàn)胰島素抵抗后,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素27mg/kg,NC組注射同等劑量檸檬酸鈉緩沖液,兩組大鼠以原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。72h后測(cè)定血糖值,以隨機(jī)血糖≥16.7mmo

6、l/L者為2型糖尿病大鼠造模成功,共成模24只。將成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM組)和PDTC治療組(PDTC組)。PDTC治療組腹腔注射PDTC50mg/kg/d,NC組和DM組每日注射同等劑量的的生理鹽水。
　　 各組大鼠每周監(jiān)測(cè)血糖和體重。每組大鼠于注射STZ前做口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。大鼠自采血前一日20:00PM起禁食,實(shí)驗(yàn)日8:00AM分別從內(nèi)眥靜脈取血3ml,分離血清,用于血糖、胰島素及血脂水平的檢測(cè)。PD

7、TC治療1周后,斷頭處死動(dòng)物,分別留取大鼠心肌組織用于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、心肌細(xì)胞凋亡率、iNOS、NF-κB蛋白含量的測(cè)定及心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　 1：血糖、胰島素的測(cè)定血糖采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定。胰島素采用ELISA法測(cè)定。應(yīng)用穩(wěn)態(tài)模型

8、胰島素抵抗指數(shù)(homeoestasis model assessment of insulinresistance,HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗的程度。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5表示胰島素抵抗的程度;ISI=1/(FBG×FINS),表示胰島素敏感性,均使用自然對(duì)數(shù)表示。
　　 2：口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)OGTT以2g/

9、kg葡萄糖灌胃,分別測(cè)定0min、30min、60min、90min、120min血糖及胰島素水平。
　　 3：血脂的測(cè)定
　　 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平,采用Cu2+比色法測(cè)定游離脂肪酸(FFA)的水平。
　　 4：心肌組織SOD、GSH-Px活力和MDA含量的測(cè)定取心肌組織200mg,制備10％組織勻漿,

10、4℃3000r/min離心15min,留上清,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定SOD、GSH-Px的活力及MDA的含量。
　　 5：心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察各組大鼠心肌組織經(jīng)10％中性福爾馬林溶液固定24小時(shí)后,石蠟包埋后制備組織切片,行HE及iNOS、NT免疫組化染色;大鼠心肌經(jīng)4％戊二醛溶液固定24小時(shí)后,制備電鏡組織切片,透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 6：心肌細(xì)胞凋亡率測(cè)定經(jīng)70％乙醇固定的心肌組織,制備單細(xì)胞

11、懸液,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)一步染色法,4℃染色30 min,流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定凋亡細(xì)胞百分率。
　　 7：心肌組織iNOS、NF-κB蛋白含量測(cè)定提取心肌組織細(xì)胞漿蛋白與核蛋白,經(jīng)Western-blot檢測(cè)心肌組織中iNOS、NF-κB的相對(duì)表達(dá)量。
　　 8：統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件處理。計(jì)量資料以-x±s表示,兩組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行

12、比較;多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1：注射STZ前兩組大鼠的比較；
　　 1.1：兩組體重的比較實(shí)驗(yàn)開始時(shí),大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)和高脂飲食組(HFD組),兩組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。喂養(yǎng)8周后,HFD組大鼠體重(361.92±19.22g)明顯高于NC組(313.17±19.95g)(P＜0.01)。
　　 1.2：兩組大鼠

13、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR和ISI的比較大鼠喂養(yǎng)8周后,HFD組與NC組空腹血糖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;HFD組空腹胰島素水平(18.01±2.63μIU/ml)明顯高于NC組(10.67±0.83μIU/ml)(P＜0.05);HFD組HOMA-IR(1.22±0.17)明顯高于NC組(0.68±0.09)(P＜0.05):HFD組ISI(-4.43±0.17)明顯低于NC組(-3.79±0.09)(P＜0.05)。
　　 1

14、.3：兩組大鼠血脂的比較大鼠喂養(yǎng)8周后,HFD組大鼠TC(8.79±1.83mmol/L)明顯高于NC組(2.18±0.11mmol/L)(P＜0.05);HFD組大鼠TG(1.12±0.31mmol/L)明顯高于NC組(0.66±0.07mmol/L)(P＜0.05);HFD組大鼠LDL(1.72±0.28mmol/L)明顯高于NC組(1.10±0.07mmol/L)(P＜0.05);HFD組大鼠FFA(1.82±0.14mEq/L)

15、明顯高于NC組(1.27±0.13mEq/L)(P＜0.05)。
　　 1.4：兩組大鼠OGTT的比較大鼠喂養(yǎng)8周后,行OGTT結(jié)果顯示:HFD組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖水平均較NC組明顯升高,其中90min、120min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平比較有顯著性差異(P＜0.05);HFD組大鼠各時(shí)間點(diǎn)胰島素水平較NC組明顯升高(P＜0.05)。
　　 2：注射STZ后各組大鼠指標(biāo)比較；
　　 2.1：各組大鼠空腹血糖的比較8周末

16、,HFD組注射STZ72h后,HFD組大鼠空腹血糖(26.16±3.38mmol/L)明顯高于NC組(4.41±0.56mmol/L)(P＜0.01)。24只HFD組大鼠隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L,確定為2型糖尿病大鼠。PDTC治療1周后大鼠空腹血糖(11.55±2.89mmol/L)明顯低于DM(26.55±2.90mmol/L)組(P＜0.01)。
　　 2.2：各組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活力及MDA含量的比較

17、DM組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px的活力明顯低于NC組(P＜0.05),PDTC治療組大鼠的SOD、GSH-Px活力明顯高于DM組(P＜0.05);DM組大鼠心肌組織的MDA含量明顯高于NC組(P＜0.05),PDTC治療后大鼠心肌的MDA含量明顯低于DM組(P＜0.05)。
　　 2.3：各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化；
　　 2.3.1：HE染色觀察各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)變化NC組心肌細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞核大小均一,胞漿染

18、色均勻;DM組心肌纖維排列紊亂,心肌細(xì)胞變性壞死,心肌細(xì)胞間脂肪細(xì)胞、炎細(xì)胞浸潤(rùn);PDTC組較DM組病變減輕。
　　 2.3.2：免疫組化觀察各組大鼠心肌中iNOS、NT的表達(dá)iNOS和NT在DM組大鼠心肌表達(dá)水平均明顯高于NC組;PDTC治療后大鼠心肌組織中iNOS和NT的表達(dá)均明顯低于DM組。
　　 2.3.3：各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),NC組:肌節(jié)對(duì)位整齊,線粒體結(jié)構(gòu)完好;DM組:部分肌

19、節(jié)錯(cuò)位,線粒體有嵴和膜的損傷,線粒體髓樣化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,糖原顆粒堆積,有脂滴;PDTC治療組:肌節(jié)對(duì)位基本整齊,線粒體內(nèi)只見很少數(shù)嵴溶解,肌漿網(wǎng)擴(kuò)張有改善。
　　 2.4：心肌細(xì)胞凋亡率測(cè)定DM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率(25.88±1.63％)明顯高于NC組(18.75±3.47％)(P＜0.01);PDTC治療組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于DM組(20.99±4.01％)(P＜0.05)。
　　 2.5：心肌組織中iNOS、

20、NF-κB蛋白含量測(cè)定DM組iNOS的蛋白含量明顯高于NC組,有顯著性差異(P＜0.05);PDTC治療組iNOS的蛋白含量明顯低于DM組,有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 各組總的NF-κB的含量無(wú)明顯差別。DM組胞核NF-κB的蛋白含量明顯高于NC組,有顯著性差異(P＜0.05);PDTC治療組NF-κB的蛋白含量明顯低于DM組,有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1：通過(guò)高脂飲食可造成大