BVES對P19CL6心肌細胞分化和增殖作用的機制研究.pdf

1、目的：探討B(tài)VES對P19CL6心肌細胞分化及增殖的作用及其機制，為先天性心臟病的發(fā)病機制奠定一定的理論基礎。
　　方法：實驗采用P19C16細胞體外心肌細胞分化模型、1％DMSO可誘導其分化為成熟跳動的心肌細胞。含BVES基因片段的質粒過表達P19CL6細胞上調內源性BVES表達，BVES特異性siRNA轉染P19CL6細胞沉默內源性BVES表達。qRT-PCR實驗定量檢測轉錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)、心臟基因

2、(MYH6、MYL7)、目的基因BVES和RhoA的mRNA表達水平，western blotting定量檢測心肌肌鈣蛋白(cTnT)蛋白水平表達，免疫熒光檢測心肌骨架蛋白MF20和Actinin蛋白水平表達。CCK-8實驗檢測細胞數(shù)量、EdU實驗檢測細胞DNA合成、細胞流式檢測細胞周期。
　　結果：成功構建P19CL6細胞體外心肌細胞分化模型，P19CL6細胞在含1％DMSO培養(yǎng)基誘導分化12天后，免疫熒光染色顯示心肌細胞骨架蛋

3、白Actinin陽性細胞明顯增多，qRT-PCR顯示心臟轉錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)及心臟基因(MYL7、MYH6)的mRNA表達在P19CL6心肌細胞分化過程表達逐漸升高。BVES表達在P19CL6細胞心肌細胞分化過程被誘導表達。BVES質?？缮险{P19CL6細胞內源性BVES蛋白和mRNA表達，BVES特異性siRNA可有效抑制P19CL6細胞內源性BVES蛋白和mRNA表達。免疫熒光染色結果顯示過表達BVES可減

4、少P19CL6心肌細胞分化數(shù)量，qRT-PCR結果顯示過表達BVES抑制P19CL6心肌分化轉錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)及心臟基因(MYL7、MYH6) mRNA表達，western blotting結果顯示過表達BVES抑制心肌細胞分化晚期心肌肌鈣蛋白(cTnT)蛋白表達。免疫熒光染色結果顯示沉默BVES表達可增加P19CL6向心肌細胞分化數(shù)量，qRT-PCR結果顯示沉默BVES促進P19CL6心肌分化心臟基因(MY

5、L7、MYH6) mRNA表達，但對P19CL6心肌細胞分化過程心臟轉錄因子(Gata4、Nkx2.5、Tbx5)表達無影響，western blotting結果顯示沉默BVES表達可促進分化晚期心肌肌鈣蛋白(cTnT)蛋白表達。流式細胞學實驗顯示過表達BVES可抑制心肌細胞周期循環(huán)、使心肌細胞保持在G0/G1期，EdU結果顯示過表達BVES抑制心肌細胞DNA合成，CCK8結果顯示過表達BVES可減少心肌細胞增殖，但沉默BVES表達對心