雙重抗肺纖維化基因嵌合重組體蛋白的研制.pdf

1、目的：中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)是整合素B2的專一性拮抗劑，能抑制中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和聚集，阻止白細(xì)胞的滲透和浸潤。角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)是成纖維細(xì)胞生長因子家族中的一員，由間充質(zhì)細(xì)胞分泌并特異性地作用于上皮細(xì)胞促進(jìn)其生長繁殖。許多實(shí)驗(yàn)均證明KGF和NIF在肺臟的發(fā)育、炎癥和修復(fù)中發(fā)揮重要的作用。針對NIF能夠抑制病理性自身免疫反應(yīng)和KGF能夠修復(fù)損傷的肺泡上皮及抑制纖維化的功效，我們構(gòu)建了這兩種細(xì)胞因子的基因嵌合重組體，

2、并進(jìn)行表達(dá)，目的是研制能夠治療急性肺損傷和肺纖維化的重組蛋白，為進(jìn)一步的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法：以8個(gè)甘氨酸作為鉸鏈區(qū)，運(yùn)用over-lapPCR的方法將NIF與KGF連接，獲得雙重抗肺纖維化基因嵌合重組體NKM的基因序列。利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)，在BL21Star(DE3)plysS大腸桿菌中高效表達(dá)NKM。經(jīng)過測序、誘導(dǎo)表達(dá)、純化和Western-Blot等確證后，再對NKM的體內(nèi)外活性進(jìn)行測定。結(jié)果：本研究成功構(gòu)建了雙重抗肺纖維

3、化基因重組嵌合體NKM；并在BL21Star(DE3)plysS大腸桿菌中表達(dá)量達(dá)到25％；經(jīng)Western-Blot檢測有免疫活性；通過DEAE層析柱純化得到純度為80％的NKM；體外細(xì)胞活性測定表明，NKM對白細(xì)胞粘附有劑量依賴性的抑制作用，對成纖維細(xì)胞生長也有劑量依賴性的抑制作用；動物體內(nèi)活性測定顯示，NKM抑制急性肺損傷后循環(huán)內(nèi)白細(xì)胞的增加；病理解剖顯示NKM能明顯抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺炎和肺纖維化。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)獲得了具有雙重功能