抗肺纖維化新藥吡非尼酮的藥代動力學(xué)研究.pdf

1、特發(fā)性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)為間質(zhì)性肺疾病(interstitiallungdisease)最為嚴(yán)重的一種表現(xiàn)形式，是以彌漫性肺泡慢性炎癥和間質(zhì)纖維化為主要病理特征的疾病。近年來間質(zhì)性肺纖維化的發(fā)病率呈上升趨勢。目前在世界范圍內(nèi)將近有500萬人罹患此癥，該類患者平均壽命僅為2.8年，每年約40000患者因之而死亡。此病在我國發(fā)病率也有明顯增加。 吡非尼酮(pirfenidone

2、PF)是一種新型的廣譜抗纖維化藥物，其結(jié)構(gòu)是5-甲基1-苯基2(1氫)吡啶酮(5methyl-1-phenyl-2(1H)-pyridone)。它能抑制膠原的合成，阻止甚至逆轉(zhuǎn)纖維化發(fā)生和瘢痕形成。本品易于為胃腸道所吸收，在體內(nèi)各組織中分布廣泛，可通過血腦屏障?；诒酒穼δ[瘤壞死因子-α(TNF-α)的拮抗作用，有可能被用于多發(fā)性硬化癥(MS)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的治療。作為特發(fā)性肺纖維化治療藥物，PF已經(jīng)被認(rèn)定為罕用病治療藥物(o

3、rphandrug)在美國進(jìn)行各項開發(fā)研究，并根據(jù)美國一項名為“EarlyAccessProgram”項目用于一定數(shù)量的特發(fā)性肺纖維化患者。同時，本品也亦已被日本厚生省指定為“孤兒藥物”。2003年，InterMune公司宣布的一項隨機(jī)雙盲多中心Ⅱ期臨床研究結(jié)果表明，本品治療特發(fā)性肺纖維化比皮質(zhì)激素潑尼松更為有效。此項研究共入選53例患者，其中，中至重度特發(fā)性肺纖維化患者有46例，繼發(fā)性肺纖維化患者7例?；颊呙咳湛诜F40mg·kg-

4、1或潑尼松0.33mg·kg-1。接受治療12個月后，以最低氧飽和度為考察指標(biāo)，結(jié)果顯示本品的治療效果優(yōu)于潑尼松；6分鐘步行測試結(jié)果表明治療組療效明顯優(yōu)于潑尼松治療組(p=0.014)。通過對其它臨床終點指標(biāo)的考察，如用力肺活量(FVC)、步行距離等，本品治療組也均優(yōu)于潑尼松組，且具有良好的耐受性。PF的抗纖維化作用已經(jīng)在多種試驗動物纖維化模型中得到證實。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)PF能抑制成纖維細(xì)胞的增殖和活性，減少TGF-β的表達(dá)。在博萊霉素

5、誘導(dǎo)的鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)它能抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PDGF，減少羥脯氨酸的產(chǎn)生，并能改善肺功能。 第一部分吡非尼酮的藥物代謝動力學(xué)研究 新藥吡非尼酮(Pirfenidone，PF)的主要藥效學(xué)實驗結(jié)果顯示，該藥具有良好的抗肺纖維化作用。吡非尼酮的抗肺纖維化作用在國際上亦得到廣泛研究。該藥的研究與開發(fā)對有效防治肺纖維化病變具有重要意義。本項工作采用SD大鼠及beagle犬進(jìn)行該藥的藥代動力學(xué)

6、研究工作，揭示其在二種動物體內(nèi)的處置規(guī)律，為該藥的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 第一節(jié)吡非尼酮的藥動學(xué)特征 第二節(jié)吡非尼酮在大鼠體內(nèi)組織分布研究 大鼠按100mg·kg-1劑量灌胃給予PF后，分別于10、60、150min處死。樣品經(jīng)HPLC法檢測組織PF濃度。結(jié)果表明，大鼠給藥后PF在各組織中均有分布，其中尤以胃腸道及血流豐富的組織，如脾、肝、心、腎、肺等組織中濃度較高。PF在腦中亦有較高分布，說明該藥能透過血腦屏

7、障。 第三節(jié)吡非尼酮在大鼠體內(nèi)排泄研究 大鼠灌胃給予PF后，經(jīng)與空白尿樣比較，尿中未發(fā)現(xiàn)PF原形，而主要以代謝物M1、M2形式從尿中排泄；經(jīng)與空白糞便樣比較，糞便中僅發(fā)現(xiàn)痕量PF原形，該藥主要以二種代謝物形式排泄；經(jīng)與空白膽汁比較，膽汁中亦發(fā)現(xiàn)痕量PF原形，亦發(fā)現(xiàn)代謝物M1和少量的M2。 初步的試驗結(jié)果表明，PF主要以代謝物的形式從尿中排泄。另有少量代謝物及痕量的原形從糞便及膽汁中排泄。由于無代謝物對照品，尚未作

8、定量檢測。 第四節(jié)吡非尼酮血漿蛋白結(jié)合率試驗 本實驗采用平衡透析法研究吡非尼酮血漿蛋白結(jié)合率，并進(jìn)行人和大鼠PF血漿蛋白結(jié)合率的比較。用高效液相色譜法測定平衡透析膜兩側(cè)的PF藥物濃度，透析膜一側(cè)為空白血漿，另外一側(cè)為含PF2mg·L-1、20mg·L-1、100mg·L-1藥物濃度的NaH2PO4緩沖液，平衡時間為24小時。在2mg·L-1～100mg·L-1PF濃度范圍內(nèi)，PF人血漿蛋白結(jié)合率分別為77.78％、71.

9、67％、66.19％，PF大鼠血漿蛋白結(jié)合率分別為64.09％、84.92％、84.27％。 第二部分吡非尼酮對大鼠肝細(xì)胞色素P450酶活性的影響 第一節(jié)吡非尼酮對大鼠P450酶總酶活性的影響 采用差示光譜法測定微粒體混懸液蛋白中細(xì)胞色素P450含量。SD大鼠48只，隨機(jī)分成空白組、肝藥酶誘導(dǎo)劑組、肝藥酶抑制劑組，吡非尼酮低劑量組、吡非尼酮中劑量組和吡非尼酮高劑量組?？瞻捉M給予1％CMC-Na，誘導(dǎo)劑組地塞米松1

10、00mg·kg-1，抑制劑組酮康唑40mg·kg-1，PF低、中、高劑量組分別為PF25mg·kg-1，50mg·kg-1和100mg·kg-1灌胃給藥，一日一次，連續(xù)6日。取大鼠的肝臟制備肝微粒體，測定肝微粒體中的蛋白濃度，用分光光度計對樣品進(jìn)行比色。結(jié)果表明，該藥在中劑量組(50mg·kg-1)和高劑量組(100mg·kg-1)的P450含量與空白組比較有顯著性差異(P＜0.01)，提示該藥在較大劑量時對肝藥酶有誘導(dǎo)作用。

11、第二節(jié)吡非尼酮對CYP3A及CYP2E1的影響作用 采用Nash-甲醛形成法(Nash比色法)來研究吡非尼酮對大鼠CYP3A及CYP2E的影響，配制0.5ml反應(yīng)液，加入NADPH生成系統(tǒng)啟動反應(yīng)，37℃水浴20min后，加入20％ZnSO40.05ml終止反應(yīng)，混勻后每管再加入飽和Ba(OH)20.05ml，2500g離心15～20min，將0.35ml上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，加入0.15mlNash試劑，混勻后加入50℃水浴

12、溫孵30min，冷卻后在412nm測定樣品光密度值。結(jié)果表明，在給藥6d和12d后，吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶(反映CYP2E1)的活性影響不顯著(P＞0.05)；而吡非尼酮對大鼠肝微粒體ERD酶(反映CYP3A)具有顯著的誘導(dǎo)作用(P＜0.01)并有明顯的時間依賴性。 第三部分吡非尼酮的代謝產(chǎn)物研究 第一節(jié)吡非尼酮的主要代謝產(chǎn)物及代謝途徑 用LC-MS/MS法首次檢測出大鼠及健康受試者口服PF后，在尿樣及

13、膽汁樣中存在微量原形及10種代謝產(chǎn)物。其中M1為PF的5位甲基羥基化產(chǎn)物，M2為M1的羥甲基進(jìn)一步氧化為羧酸的產(chǎn)物，M3、M4為二羥基化產(chǎn)物，M5、M6和M7為在二羥基化產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，5位羥甲基不穩(wěn)定，進(jìn)一步氧化為羧酸的產(chǎn)物，M7、M8和M9為代謝物M1、M2與葡萄糖醛酸結(jié)合形成的二相代謝產(chǎn)物。上述代謝物文獻(xiàn)中均未見報道。 大鼠口服PF后，在體內(nèi)迅速代謝，其代謝物分別從膽汁及尿中排除體外，其中尿為主要排泄形式。尿中M2含量最高，

14、為主要的代謝產(chǎn)物，其次為M1。文獻(xiàn)報道吡非尼酮在小鼠體內(nèi)代謝迅速且完全，尿樣中未發(fā)現(xiàn)母體化合物。本試驗亦證明PF在大鼠體內(nèi)代謝迅速，但尿中仍檢測到痕量原形化合物，說明吡非尼酮雖代謝迅速但不完全。 大鼠口服PF后，其原形及代謝物均廣泛分布于各組織中。通過對其靶器官肺組織的LC-MS檢測，發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)分子離子為m/z202和216的化合物，其質(zhì)譜圖與尿中M1和M2相同，故可推定為PF的醇化產(chǎn)物和羧酸化產(chǎn)物。 健康受試者口服PF后，

15、其原形及代謝物亦主要隨尿排泄。尿中代謝物M2含量最高，為主要的代謝產(chǎn)物。在人尿中代謝物M1相對含量低于大鼠，而二相代謝產(chǎn)物的相對含量要高于大鼠。人尿中未檢測到準(zhǔn)分子離子為m/z232的三個代謝物M5、M6、M7。 根據(jù)檢測結(jié)果可以推斷，吡非尼酮在大鼠及健康受試者體內(nèi)的主要代謝途徑為：吡非尼酮吡啶環(huán)上的5位甲基先氧化為醇成為PF羥基化產(chǎn)物M1，M1的羥甲基進(jìn)而氧化為羧酸M2。M1、M2再與葡萄糖醛酸結(jié)合后產(chǎn)生二相代謝產(chǎn)物M7、M8

16、和M9而排出體外。其次還產(chǎn)生少量的二羥基化產(chǎn)物M3，M4。 第二節(jié)吡非尼酮的主要代謝產(chǎn)物M2的結(jié)構(gòu)確定 20只大鼠灌胃口服PF100mg·kg-1后1h，心室采血，收集血漿，樣品經(jīng)提取后用半制備色譜柱分離，收集M2流份，經(jīng)減壓干燥、醋酸乙酯萃取、適量去離子水洗三次后，減壓除去溶劑，用于純度鑒定及結(jié)構(gòu)鑒定。分離提純后的吡非尼酮主要代謝產(chǎn)物M2經(jīng)HPLC純度鑒定為97.2％。經(jīng)UV、IR、MS和NMR綜合解析，M2的結(jié)構(gòu)確證