癲癇反復(fù)發(fā)作、腦損傷以及卡馬西平對大鼠腦內(nèi)P-糖蛋白表達及調(diào)節(jié)的影響.pdf

1、目的：盡管不斷有新的抗癲癇藥物(antiepilepticdrugs，AEDs)用于臨床，但是仍有近30％的癲癇患者不能控制發(fā)作而成為難治性癲癇，其主要的臨床特征是同時對多種結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的AEDs均產(chǎn)生耐藥，即多藥耐藥(multipledrugresistance，MDR)，表明難治性癲癇的耐藥機制是一種非特異性機制。第一個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤MDR形成機制有關(guān)的藥物外流轉(zhuǎn)運體是P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，由

2、mdr1基因編碼。受腫瘤非特異性MDR機制的啟示，1995年首次發(fā)現(xiàn)臨床難治性癲癇患者手術(shù)切除的病變腦組織存在P-gp的過表達，并在多種急、慢性癲癇動物模型中得到證實，但是目前對難治性癲癇患者P-gp過表達的機制了解較少。部分來自臨床流行病學(xué)的資料顯示，癲癇的反復(fù)發(fā)作、腦損傷以及AEDs的應(yīng)用是除個體遺傳因素外影響難治性癲癇患者mdr1/P-gp表達的三種最重要因素。然而，上述三種因素在對P-gp的表達影響中哪種因素處于主要地位、是否同

3、時發(fā)揮作用、三種因素間的相互關(guān)系如何、參與P-gp表達的調(diào)節(jié)因素有哪些以及P-gp的亞細胞定位等，目前都還缺乏了解。 本實驗擬通過同時建立癲癇反復(fù)發(fā)作模型-戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)點燃模型、大腦中動脈永久阻塞(Middlecerebralarteryocclusion，MCAO)腦缺血缺氧損傷模型以及AED卡馬西平(carbamazepine，CBZ)干預(yù)三種模型，研究上述三種因素對P-gp表達的影響

4、及相互關(guān)系；確定P-gp的表達部位及其功能聯(lián)系；分析低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)表達對mdr1/P-gp表達的調(diào)節(jié)作用。從而為指導(dǎo)臨床用藥和尋求通過阻斷mdr1基因編碼蛋白-P-gp的高表達以減少抗癲癇藥物耐藥性形成、提高藥物療效以及開發(fā)新型AEDs提供第一手的實驗資料和理論依據(jù)。 方法：1實驗動物及分組：健康雌性SD大鼠116只，隨機分為3組：PTZ點燃模型組(42只)

5、、大腦中動脈永久阻塞模型組(52只)、AED-CBZ應(yīng)用組(22只)。 2模型制備：2.1PTZ點燃模型組：隨機分為對照組(6只)和實驗組(36只)。實驗組分2h、4h、12h、24h、48h、1w組，每組6只；腹腔注射戊四氮40mg/kg，每日2次。對照組同時注射等劑量的生理鹽水。給藥后觀察30～60min。行為學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)按照Smialowki6級記分法。點燃成功標(biāo)準(zhǔn)：給藥后連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級或Ⅴ級發(fā)作。 2.2MCAO

6、模型組：隨機分為3組：對照組(5只)、假手術(shù)組(5只)和模型組(42只)。模型組分為缺血2h組、6h組、12h組、24h、48h、72h組，每組各7只。采用線栓法制作MCAO模型；假手術(shù)組，除不插線外，其余操作相同；對照組不做任何處置。模型完成2h后參考Longa和Bederson的5分制評分方法進行神經(jīng)功能缺失體征評分。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后評分≥1分。 2.3CBZ干預(yù)組：隨機分為對照組(4只)和實驗組(18只)。實驗組分為1w

7、、2w、4w組，每組各6只；給藥量：人每日最大劑量(20mg/kg)×鼠體重(kg)×6.25(由體表面積換算得到)。給藥方法：每日一次，早8：00～10：00灌胃給藥；對照組同時給予等量的生理鹽水。并分別選取2w和4w組各4只，熒光偏振檢測法測定血藥濃度的谷濃度。 3.P-gp和HIF-1α檢測：所有實驗動物均在相應(yīng)的時間點灌殺、取腦組織、切片，免疫組織化學(xué)SP法檢測P-gp和HIF-1α的表達情況，并分別和神經(jīng)元的特異性標(biāo)記

8、物-NeuN以及星形膠質(zhì)細胞的特異性標(biāo)記物-GFAP進行DAB和TMB進行雙重標(biāo)記染色，確定二者的表達部位。 4.統(tǒng)計學(xué)方法：同一組不同時間點行單因素方差分析。結(jié)果：1.行為學(xué)表現(xiàn)：1.1PTZ點燃模型組：動物除2只死于癲癇持續(xù)狀態(tài)外，其余動物均全部點燃，點燃成功率95％。對照組無癲癇發(fā)作。 1.2大腦中動脈阻塞模型組：動物24h和48h組，分別有2只和4只死亡。模型成功率為80％。假手術(shù)組和對照組無行為異常表現(xiàn)。

9、 1.3CBZ干預(yù)組：除3只動物血藥濃度高于12.00μg/ml，2只動物血藥濃度低于4.00μg/ml，其余均在有效血藥濃度范圍內(nèi)：4.34～10.65μg/ml(有效血藥濃度范圍4.00～12.00μg/ml)。模型組和對照組相比無行為異常表現(xiàn)。 2.P-gp和HIF-1α的表達和分布：2.1對照組：二者零星分布于血管內(nèi)皮細胞，并和特異性內(nèi)皮細胞標(biāo)記物-ECA進行免疫組織化學(xué)雙標(biāo)證實；腦實質(zhì)細胞上未見表達。 2.2

10、PTZ點燃模型組：P-gp和HIF-1α的免疫陽性物質(zhì)同時在發(fā)作后2h開始出現(xiàn)，4h達到高峰，以海馬CA1區(qū)明顯，隨后開始回落，1w后降至對照組水平。主要分布于海馬和皮層細胞的細胞膜及細胞漿。P-gp和HIF-1α在血管內(nèi)皮細胞的表達和對照組無差異。 2.3MCAO模型組：動物缺血后2h已經(jīng)出現(xiàn)在損傷側(cè)皮層和紋狀體的血管內(nèi)皮細胞和腦實質(zhì)細胞，腦實質(zhì)細胞P-gp和HIF-1α的表達主要存在于細胞膜和細胞質(zhì)；并迅速達到高峰，隨后逐漸

11、減少，而周圍邊緣區(qū)域開始增多，以血管內(nèi)皮細胞表達增多明顯；直到72h不能被檢測到，損傷對側(cè)皮層和紋狀體未見血管內(nèi)皮細胞和腦實質(zhì)細胞的表達。 2.4CBZ干預(yù)組：全部動物P-gp和HIF-1α表達散在分布于血管內(nèi)皮細胞，腦實質(zhì)細胞未見其表達，和對照組相比，有增多趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.5P-gp和HIF-1α的表達部位：二者與神經(jīng)元特異性標(biāo)記物(Neu-N)的免疫組化雙標(biāo)結(jié)果證實，點燃模型組和缺血模型組動物的P-gp和

12、HIF-1α均共存于神經(jīng)元，且其表達部位和分布模式非常相似，提示HIF-1α可能參與了P-gp的表達調(diào)節(jié)。 結(jié)論：本研究在成功建立三種動物模型的基礎(chǔ)上，通過比較三種因素對P-gp的影響，分析P-gp和HIF-1α表達的關(guān)系，得出以下結(jié)論： 1無神經(jīng)毒性的PTZ的點燃模型操作簡單、成功率高，能更好地反映癲癇的反復(fù)發(fā)作對P-gp表達的影響。 2在大鼠PTZ點燃模型中發(fā)現(xiàn)，癲癇的反復(fù)發(fā)作可以誘導(dǎo)海馬和皮層腦實質(zhì)細胞-神

13、經(jīng)元P-gp的表達。 3在線栓法MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，腦組織缺血、缺氧可以誘導(dǎo)損傷同側(cè)皮質(zhì)和紋狀體區(qū)的血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元P-gp的表達明顯增多。 4CBZ的應(yīng)用對P-gp的表達無顯著影響。 5癲癇的反復(fù)發(fā)作、腦缺血缺氧性損傷對P-gp的表達存在表達時限和表達部位上的不同，以缺血缺氧性腦損傷的誘導(dǎo)作用最為明顯，其次是癲癇的反復(fù)發(fā)作。從病理生理學(xué)的角度考慮，引起P-gp表達變化的原因可能和缺氧有關(guān)。 6在PT