靈芝多糖肽對P-糖蛋白影響的研究.pdf

1、一、目的
　　 研究靈芝多糖肽對Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白表達(dá)和功能的影響，以及靈芝多糖肽對羅丹明123(P-糖蛋白底物)在Caco-2單層細(xì)胞模型上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　 二、方法
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證
　　 人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)采用DMEM高糖培養(yǎng)基，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)采用RPMI-1640培基，細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行P-糖蛋白表達(dá)驗(yàn)證。
　　 2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2、　　 用MTT(苯基溴化四氮唑藍(lán)法)分別考察靈芝多糖肽、環(huán)孢素、維拉帕米對Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響，選擇細(xì)胞存活率選大于90％的濃度作為最大無毒劑量進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　 3靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能的影響用流式細(xì)胞儀測定Caco-2細(xì)胞中P-糖蛋白底物羅丹明-123的熒光強(qiáng)度，維拉帕米為陽性對照，考察靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能的影響。
　　 4靈芝多糖肽對P-糖蛋白表達(dá)的影響
　　 藥物與Caco-

3、2細(xì)胞作用72h后，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)抗體的熒光強(qiáng)度，以環(huán)孢素作為陽性誘導(dǎo)作用對照，不干預(yù)處理的Caco-2細(xì)胞作為陰性對照，分析靈芝多糖肽對P-糖蛋白表達(dá)的影響。
　　 5靈芝多糖肽對羅丹明-123轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 在建好的Caco-2細(xì)胞單層模型上研究羅丹明-123雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，以維拉帕米作為陽性對照組，考察靈芝多糖肽對羅丹明-123跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。
　　 三、結(jié)果
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)驗(yàn)

4、證
　　 ECV304細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞在正常情況下生長迅速;Caco-2細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白，適用于研究靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能、表達(dá)的影響;ECV304細(xì)胞極低表達(dá)P-糖蛋白，可作為陰性對照細(xì)胞。
　　 2細(xì)胞毒性試驗(yàn)
　　 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈芝多糖肽對Caco-2細(xì)胞的最大無毒濃度為100μg/mL，0.01-100μmol/L維拉帕米、0.01-10μmol/L環(huán)孢素A對細(xì)胞無明顯毒性，由Caco

5、-2細(xì)胞確定的各組藥物濃度對陰性對照ECV304細(xì)胞也無細(xì)胞毒性。因此選用0.1-100μg/mL的靈芝多糖肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　 3靈芝多糖肽對P-糖蛋白功能的影響
　　 與陰性對照組對比研究發(fā)現(xiàn)，藥物與細(xì)胞作用1h后，10、20、50、100μg/mL的靈芝多糖肽能抑制Rh-123的外排，外排量降低了8％、16％、19％、33％(p＜0.05)，具有濃度依賴性。
　　 4靈芝多糖肽對P-糖蛋白表達(dá)的影響

6、>　　 在蛋白水平上，細(xì)胞與藥物共同作用3天后，高、中濃度實(shí)驗(yàn)組(100、50μg/mL)細(xì)胞內(nèi)的抗體熒光強(qiáng)度低于陰性對照組(P＜0.05)，分別降低了10.6％、7.6％。低濃度組(20μg/mL)抗體熒光強(qiáng)度較陰性對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明較高濃度的靈芝多糖肽能降低Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白的表達(dá)，與功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。
　　 5靈芝多糖肽對羅丹明-123轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 羅丹明-123在Caco-2細(xì)胞

7、上雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物干預(yù)3小時(shí)后，與陰性對照組Rh-123組相比，高、中(50，100μg/mL)濃度組Rh-123從BL-AP側(cè)的滲透系數(shù)(Papp)下降，外排率較陰性對照組降低了15％、18％(p＜0.05)。說明靈芝多糖肽對P-糖蛋白有一定的抑制作用，與功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　 四、結(jié)論
　　 1靈芝多糖肽短時(shí)間(1h)內(nèi)可抑制Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白的活性，長期應(yīng)用高、中濃度的靈芝多糖肽(3d)可

8、抑制P-糖蛋白的表達(dá)。提示靈芝多糖肽與P-糖蛋白底物合用時(shí)，可能會發(fā)生藥物相互作用。靈芝多糖肽可使P-糖蛋白底物在細(xì)胞內(nèi)濃度增加，推測靈芝多糖肽與抗腫瘤藥共同使用可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象，提高療效。
　　 2高、中濃度的靈芝多糖肽對羅丹明-123(Rh-123)在Caco-2細(xì)胞上的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的抑制作用，而低濃度靈芝多糖肽對Rh-123雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)無明顯影響，提示靈芝多糖肽可能對P-糖蛋白親和力不高，是否為P-糖蛋白底物需要進(jìn)