懷山藥微型塊莖誘導(dǎo)形成相關(guān)基因DoBBX6和DoBBX17的克隆、結(jié)構(gòu)分析及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、懷山藥（Dioscorea opposita Thunb.）是我國著名的“四大懷藥”之一，藥食兼優(yōu)。為解析其微型塊莖誘導(dǎo)形成的分子機制，本研究以其優(yōu)良種質(zhì)——鐵棍山藥為試材，在前期微型塊莖轉(zhuǎn)錄組分析研究的基礎(chǔ)上，對篩選到的微型塊莖誘導(dǎo)形成的潛在相關(guān)基因DoBBX6和DoBBX17進(jìn)行克隆，并對其序列、蛋白結(jié)構(gòu)及生化特性進(jìn)行深入分析；為進(jìn)一步研究基因的功能，分別構(gòu)建了RNAi和過表達(dá)載體，并將過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入馬鈴薯中。研究結(jié)果如下：

2、　　1.DoBBX6和DoBBX17的克隆及序列分析
　　采用RACE技術(shù)從微型塊莖中分離到了DoBBX6和DoBBX17基因cDNA全長。DoBBX6基因cDNA全長1332bp，開放閱讀框長1041bp，共編碼347個氨基酸，在N端有兩個串聯(lián)的B-box保守結(jié)構(gòu)域，在C端有一個CCT結(jié)構(gòu)域；DoBBX17基因cDNA全長為1811bp，開放閱讀框長1281bp，共編碼427個氨基酸，在N端含一個B-box保守結(jié)構(gòu)域，在C端有一

3、個CCT結(jié)構(gòu)域，這兩個基因編碼的氨基酸與其他植物具有較高的一致性，均屬于C2C2型鋅指蛋白基因。
　　2.DoBBX6和DoBBX17蛋白結(jié)構(gòu)分析
　　DoBBX6和DoBBX17蛋白的初級結(jié)構(gòu)均為酸性親水蛋白，二級結(jié)構(gòu)均以無規(guī)則卷曲、α螺旋結(jié)構(gòu)為主，兩者均不含跨膜區(qū)、信號肽，亞細(xì)胞定位預(yù)測均定位在細(xì)胞核中，且在C端CCT結(jié)構(gòu)域中含有核定位相關(guān)的NLS序列。DoBBX6蛋白無序化的比例為22.5%，DoBBX17蛋白無序化比

4、例為45.4%，且CCT結(jié)構(gòu)域均存在于蛋白的最大無序化區(qū)域內(nèi)，DoBBX6和DoBBX17蛋白均存在多個潛在的磷酸化位點。這兩個鋅指蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測其主要在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長因子等方面發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3.DoBBX6和DoBBX17蛋白的生化特性分析
　　采用瞬時轉(zhuǎn)化煙草的方法將DoBBX6、DoBBX17蛋白定位在細(xì)胞核中；通過酵母轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)研究表明二者均具有轉(zhuǎn)錄激活活性，但其保守結(jié)構(gòu)域B