ROS調(diào)控正常肝細(xì)胞增殖—靜息轉(zhuǎn)變的信號(hào)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　肝細(xì)胞通過調(diào)節(jié)自身增殖、靜息狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)變參與肝臟發(fā)育、再生、損傷修復(fù)等多種重要的生理病理過程。然而肝細(xì)胞增殖啟動(dòng)、終止的具體信號(hào)機(jī)制尚不清楚。初步研究顯示，活性氧（ROS）在此動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換過程中，具有不同的反應(yīng)和作用。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　通過不同發(fā)育時(shí)期的肝細(xì)胞模型和肝切除動(dòng)物模型，研究生長發(fā)育及肝再生過程中ROS水平變化與肝細(xì)胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變的關(guān)系，闡明ROS信號(hào)在誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵地位

2、及作用機(jī)制，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肝細(xì)胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變的自我調(diào)控過程，尋找新的調(diào)控靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法與研究方案
　　1.觀察大鼠肝臟發(fā)育過程中ROS的調(diào)控及ROS與肝細(xì)胞增殖→靜息過渡的關(guān)系
　?、俜蛛x不同發(fā)育階段的肝細(xì)胞，檢測(cè)ROS水平及細(xì)胞周期變化。
　?、跈z測(cè)以Nrf2為核心的抗氧化產(chǎn)物的表達(dá)及活性變化。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)研究ROS調(diào)控肝細(xì)胞增殖周期開、關(guān)的量效關(guān)系
　　①根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果

3、，分別選擇胎齡15-16天和成年SD大鼠的肝細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行原代分離培養(yǎng)。
　?、谕ㄟ^直接干預(yù)增殖或靜息肝細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，觀察胞內(nèi)ROS水平的改變對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及CyclinD、Rb、PCNA表達(dá)的影響，明確ROS是否在肝細(xì)胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變中起著信號(hào)調(diào)控作用，同時(shí)闡明其作用的劑量-效應(yīng)規(guī)律。
　　3.ROS對(duì)MAPKs的選擇性磷酸化作用及ROS-MAPKs-CyclinD-Rb調(diào)控通路的研究
　　①根據(jù)以

4、上結(jié)果選擇合適的干預(yù)劑量，通過降低增殖肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)其靜息或升高靜息肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)其增殖后，觀察MAPKs磷酸化改變，證實(shí)ROS對(duì)MAPKs的選擇性磷酸化激活作用。
　　②干預(yù)胞內(nèi)ROS濃度的同時(shí)，有針對(duì)性的采用特異性MAPKs抑制劑，觀察胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白表達(dá)、MAPKs磷酸化改變，進(jìn)一步證實(shí)ROS信號(hào)的上游地位，探討ROS-MAPKs-CyclinD-Rb調(diào)控通路在肝細(xì)胞增殖-靜息

5、狀態(tài)轉(zhuǎn)變中的作用。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究成年大鼠肝臟微環(huán)境H2O2水平變化對(duì)細(xì)胞靜息狀態(tài)的影響及作用機(jī)制。
　　①GOX處理大鼠，在生理范圍內(nèi)升高肝臟微環(huán)境的H2O2水平，觀察肝臟增殖能力及ERK活性改變，以證明ROS在肝細(xì)胞增殖自我調(diào)控機(jī)制中起“閥門樣”作用。
　?、谠贕OX處理的基礎(chǔ)上給予CAT清除肝內(nèi)H2O2，觀察能否對(duì)抗GOX的效應(yīng)，以證明GOX的促增殖作用與其肝內(nèi)代謝產(chǎn)物H2O2直接相關(guān)。
　?、墼贕O

6、X處理的基礎(chǔ)上給予MEK1/2選擇性抑制劑PD184161，觀察抑制ERK通路能否遏制GOX的增殖啟動(dòng)效應(yīng)，以證明ERK通路激活是H2O2啟動(dòng)肝細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究ROS信號(hào)對(duì)肝再生過程的調(diào)控
　　采用成熟的大鼠70％肝切除模型，取不同時(shí)間點(diǎn)觀察肝再生過程中ROS水平變化與肝組織增殖能力變化。同時(shí)正、反向干預(yù)肝再生早期的ROS水平，觀察對(duì)肝再生及增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響，探討ROS平衡在肝再生啟動(dòng)中的作用

7、。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.SD大鼠發(fā)育過程中，出生后15天，80％以上的肝細(xì)胞處于G0期，PCNA、Ki67、CyclinD、AFP表達(dá)下降，Rb磷酸化水平明顯降低，說明出生后2周左右，SD大鼠肝細(xì)胞結(jié)束增殖、過渡至穩(wěn)定的靜息狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體是發(fā)育過程中肝細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源，Nrf2及下游的抗氧化產(chǎn)物在不同的發(fā)育時(shí)期選擇性表達(dá)，兩者共同作用的結(jié)果為，伴隨著肝細(xì)胞由增殖過渡到靜息，ROS水平顯著降低，提示ROS

8、與細(xì)胞增殖-靜息轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。
　　2.采用NAC處理ROS水平相對(duì)較高的胚胎肝細(xì)胞，能顯著降低ROS水平，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞靜息，而p38抑制劑能顯著阻斷NAC誘導(dǎo)的細(xì)胞靜息作用。采用H2O2處理ROS水平相對(duì)較低的成年肝細(xì)胞，能顯著升高ROS水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而ERK抑制劑能顯著阻斷H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用。以上結(jié)果說明，調(diào)控ROS可以通過選擇性激活ERK或p38誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或靜息。
　　3.GOX可使肝臟ROS

9、水平增高，改變肝臟的靜息狀態(tài)，促進(jìn)增殖。CAT可以降低ROS水平，阻斷GOX的增殖啟動(dòng)作用，說明GOX的促增殖作用與其肝內(nèi)代謝產(chǎn)物H2O2直接相關(guān)。ERK特異性抑制劑可以顯著阻斷GOX的促增殖效應(yīng)，但效果弱于CAT，說明ERK通路只是ROS啟動(dòng)細(xì)胞增殖的調(diào)控通路之一。
　　4.ROS水平在肝再生過程中變化先高后低，與肝切除后再生啟動(dòng)與終止密切相關(guān)。肝再生早期，GOX處理可以升高肝臟ROS水平，加重肝切除后氧化應(yīng)激，抑制肝再生，而C

10、AT處理可以降低肝臟ROS水平，減輕肝切除后氧化應(yīng)激，但同樣抑制肝再生。說明肝再生過程中的ROS水平被精確調(diào)控在“所需”范圍內(nèi)，可能是肝再生啟動(dòng)與進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)因素。
　　結(jié)論：
　　本課題通過觀察正常肝臟發(fā)育及肝細(xì)胞再生過程中ROS的變化規(guī)律，探討ROS信號(hào)改變與肝細(xì)胞增殖-靜息相互轉(zhuǎn)變的內(nèi)在聯(lián)系，從“ROS水平的相對(duì)高低是維持肝細(xì)胞增殖或靜息狀態(tài)所必需的”這一新視角出發(fā)研究肝細(xì)胞周期自我調(diào)控的實(shí)現(xiàn)途徑，證明了“ROS信號(hào)