鋰調(diào)控缺氧NSCs增殖的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)分離培養(yǎng)及鑒定新生SD乳鼠NSCs，建立缺氧NSCs模型，以氯化鋰作為干預(yù)措施，探討鋰是否通過(guò) PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控缺氧 NSCs增殖，為臨床應(yīng)用鋰治療HIBD提供更有力的實(shí)驗(yàn)和理論證據(jù)。
　　方法：
　　1. NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定：脫頸處死新生1天內(nèi)SD乳鼠，75％酒精浸泡消毒，分離海馬組織，剔除腦膜及血管，平衡鹽溶液沖洗，剪碎海馬組織，0.25%胰酶消化后離心，重懸細(xì)胞后按5×105/m

2、l的密度接種于含無(wú)血清培養(yǎng)基的25ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2-3天半量換液一次，5-7天傳代，得到NSCs。將部分傳代 NSCs按5×105/ml的密度接種于含新生小牛血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定NSCs及其增殖分化功能。
　　2.建立缺氧NSCs模型：將傳代培養(yǎng)的NSCs按5×105活細(xì)胞/ml的密度移入無(wú)糖 DMEM培養(yǎng)基中，放入通入5%CO2和95%N2混合氣體的

3、缺氧盒，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。以通氣體時(shí)間30分鐘、1小時(shí)及2小時(shí)為檢測(cè)時(shí)相點(diǎn)，取出細(xì)胞在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)和 CCK-8法檢測(cè) NSCs活性，然后更換無(wú)血清培養(yǎng)基。以上三點(diǎn)與正常對(duì)照組存在差異，則表明缺氧 NSCs模型制作成功。
　　3.氯化鋰干預(yù)調(diào)控缺氧NSCs增殖機(jī)制：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，將傳代培養(yǎng)的NSCs分為正常對(duì)照組，單純?nèi)毖踅M，生理鹽水干預(yù)組，1mM、3mM、5mM氯化鋰干預(yù)組等6組；按5×105

4、活細(xì)胞/ml密度接種至6個(gè)35mm培養(yǎng)皿中，其中，正常對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基；其余組加入無(wú)糖 DMEM培養(yǎng)基后入自制缺氧盒，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧1小時(shí)，取出缺氧后的 NSCs顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、記數(shù)，并迅速更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，單純?nèi)毖踅M僅缺氧，生理鹽水干預(yù)組缺氧后加生理鹽水，3組氯化鋰干預(yù)組分別加入氯化鋰至所需的濃度，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后檢測(cè) Akt/P- Akt、GSK-3?/P-GSK-3

5、?、Caspase-9/P-Caspase-9。
　　結(jié)果：
　　1. NSCs分離、培養(yǎng)及鑒定：新生SD乳鼠海馬分離的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，呈懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞呈單個(gè)、成對(duì)或三個(gè)不等、折光性強(qiáng)、邊界清楚、呈亮圓形。培養(yǎng)3天后細(xì)胞增殖成發(fā)亮的圓球狀細(xì)胞團(tuán)，大小不等。培養(yǎng)5-7天時(shí)神經(jīng)球逐漸增大，數(shù)量逐漸增多，形態(tài)規(guī)則，中央部發(fā)黃，折光性明顯降低，周?chē)鸁o(wú)突起生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)同原代，經(jīng) Nestin鑒定該細(xì)胞為 N

6、SCs，BrdU證實(shí) NSCs處于增殖狀態(tài)；誘導(dǎo) NSCs分化后細(xì)胞邊緣產(chǎn)生大量突起，互相交織成網(wǎng)，呈三角形、梭形等多種形狀，經(jīng)NSE及GFAP鑒定分化的細(xì)胞為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2. NSCs缺氧模型制作：在無(wú)糖 DMEM培養(yǎng)基和缺氧盒中缺氧培養(yǎng)1小時(shí)后， NSCs形態(tài)不規(guī)則、數(shù)量減少、折光性減弱、胞體腫脹、甚至出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂；缺氧組NSCs死亡數(shù)明顯增多、活性明顯降低（P均<0.05），證明缺氧NSCs模型成功。

7、>　　3.氯化鋰調(diào)控缺氧 NSCs增殖的機(jī)制：3mM氯化鋰干預(yù)組與單純?nèi)毖踅M、生理鹽水干預(yù)組、1mM氯化鋰干預(yù)組相比紅色熒光最強(qiáng)，表明3mM氯化鋰干預(yù)組缺氧NSCs主要表達(dá)P-Akt、P-GSK-3β、P-Caspase-9標(biāo)記物；5mM氯化鋰干預(yù)組紅色熒光較3mM氯化鋰干預(yù)組減弱，綠色熒光增強(qiáng)，表明該組細(xì)胞主要表達(dá)Akt、GSK-3β、Caspase-9標(biāo)記物。1mM、3mM氯化鋰干預(yù)組P-Akt/P-GSK-3?/P-Caspase

8、-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較單純?nèi)毖踅M、生理鹽水干預(yù)組明顯增多（P<0.05）；與3mM氯化鋰干預(yù)組相比，5mM氯化鋰干預(yù)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.自制缺氧盒可以成功建立NSCs缺氧模型。
　　2.1mM、3mM氯化鋰均能促進(jìn)缺氧 NSCs增殖，但3mM氯化鋰促進(jìn)缺氧 NSCs增殖的能力較1mM氯化鋰強(qiáng)；5mM氯化鋰抑制缺氧NSCs增殖。
　　3.1mM、3mM氯化鋰干預(yù)促進(jìn)缺氧NSCs增殖

9、時(shí)，Akt、Caspase-9及GSK-3?表達(dá)逐漸減弱，P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表達(dá)逐漸增強(qiáng)。
　　4.5mM氯化鋰干預(yù)抑制缺氧NSCs增殖時(shí)，Akt、Caspase-9及GSK-3?表達(dá)逐漸增強(qiáng)，P-Akt、P-Caspase-9及P-GSK-3?表達(dá)逐漸減弱。
　　5.氯化鋰增加GSK-3?、Caspase-9酶活性與其劑量存在相關(guān)性。
　　6.氯化鋰通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控缺