端粒酶及TERT對實(shí)驗(yàn)性小鼠CVB3病毒性心肌炎的作用及黃芪甲甙干預(yù)研究.pdf

1、第一部分柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠循環(huán)血及心肌內(nèi)端粒酶和干細(xì)胞的時空變化的研究 目的: 病毒性心肌炎引起的心肌損傷作用機(jī)制并未完全清楚。本研究通過柯薩奇B3病毒性心肌炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察柯薩奇B3病毒感染對循環(huán)血及心肌內(nèi)端粒酶活性及TERT和干細(xì)胞變化情況，進(jìn)一步探討在病毒性心肌炎端粒酶及TERT和干細(xì)胞可能作用機(jī)制。 方法: 小鼠隨機(jī)接受病毒培養(yǎng)基（對照組，CON組）或病毒液（病毒組，VIR組）注射。隨后，動物根據(jù)以下幾時

2、間點(diǎn)進(jìn)一步分為六小組：注射后1天、3天、7天、14天、21天和28天。每小組取10只小鼠作觀察。從動物眼球取血分離得到循環(huán)血單個核細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析其干細(xì)胞標(biāo)記、TaqMan實(shí)時定量RT-PCR、免疫印跡技術(shù)和TRAP-ELISA法分別用來測定心肌內(nèi)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）mRNA和蛋白水平變化以及端粒酶活性變化情況。利用H&E染色、組織化學(xué)免疫染色技術(shù)觀察心肌炎癥反應(yīng)、干細(xì)胞標(biāo)記物及粒細(xì)胞過氧化酶（MPO）和活性氧（ROS）變

3、化。 結(jié)果: 1. MPO和ROS含量于感染后3天達(dá)高峰，感染后28天，基本回到正常水平。CON組與NOR組之間,MPO和ROS含量無顯著性差異。 2. 與正常組比較，對照組各時段小鼠循環(huán)血CD44+CD106+干細(xì)胞（間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物）和Sca-1+CD45+干細(xì)胞（造血干細(xì)胞）無顯著性差異。而病毒組，循環(huán)血CD44+CD106+間充質(zhì)干細(xì)胞含量于感染后3天達(dá)高峰，7天下降，而于14天基本恢復(fù)正常水平。同時，

4、循環(huán)血Sca-1+CD45+造血干細(xì)胞含量于感染后1天開始增加，并持續(xù)至感染后14天。 3. 心臟中Sca-1抗體染色陽性細(xì)胞數(shù)于感染后3天明顯增加，7天達(dá)高峰，14天仍保持不變，而28天明顯減少。各對照組之間局部心臟干細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。 4. 與NOR組和CON組比較，病毒組小鼠端粒酶表達(dá)明顯下降。病毒組TERT mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平于感染后7天和14天明顯增高，于21天下降。端?；钚砸苍诟腥竞?天和14天

5、明顯增高。而NOR組和CON組各時段TERT表達(dá)水平和端粒酶活性無顯著性改變。 結(jié)論: 本研究結(jié)果表明病毒性心肌炎小鼠中干細(xì)胞和端粒酶活性及TERT表達(dá)呈明顯時相性變化，提示在心肌損傷的病理狀態(tài)下，通過提高干細(xì)胞和端粒酶活性及TERT表達(dá)可能促進(jìn)受損心肌細(xì)胞再生與修復(fù)。并且病毒感染后2周及時細(xì)胞移植是實(shí)施心臟修復(fù)的最佳時機(jī)。 第二部分黃芪甲甙對病毒性心肌炎心肌端粒酶作用的研究 目的：觀察黃芪甲甙不同劑量干預(yù)后對病

6、毒性心肌炎小鼠端粒酶活性及其逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其治療病毒性心肌炎的藥理作用機(jī)制。 方法：Balb/c雄性4 周齡小鼠54 只，隨機(jī)分為5 組：A組（正?？瞻讓φ战M，腹腔接種0.1ml病毒培養(yǎng)液+0.1ml羥甲基纖維素鈉鹽溶液灌胃2 周，每日1 次，n=10），B組（正常黃芪對照組，腹腔接種病毒培養(yǎng)液+0.1ml 9％黃芪甲甙灌胃2周，每日1 次，n=10），C組（高劑量黃芪治療組，腹腔接種同劑量CVB3

7、+0.1ml 9％黃芪甲甙灌胃，n=10），D組（低劑量黃芪治療組，腹腔接種同劑量CVB3+0.1ml 1％黃芪甲甙灌胃，n=10），E組（模型組，腹腔接種同劑量CVB3+羥甲基纖維素溶液灌胃，n=14）。觀察14d后，眼球采血后處死動物，摘取心臟組織。分析各組小鼠的死亡率；用TRAP-ELISA法檢測外周血單個核細(xì)胞端粒酶活性；RT-PCR技術(shù)檢測心肌細(xì)胞TERT表達(dá)。 結(jié)果: A 組，B組，C組，D組,E 組的小鼠死亡率分別

8、為0％、0％、10％、30％和50％，C 組死亡率明顯低于D 組和E 組，后2 組之間無顯著差異。 TRAP-ELISA 結(jié)果顯示，A組、B組和C組外周血單個核細(xì)胞端粒酶活性均呈陽性，三者之間無顯著差異，而D 組和E 組均為陰性。RT-PCR 結(jié)果表明，C組TERT 表達(dá)明顯高于D組和E組，與A組和B組無顯著差異，而D 組與E 組之間無顯著差異，A 組和B 組之間也無顯著差異。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明病毒性心肌炎小鼠外周血