益氣活血中藥復(fù)方治療CVB-,3-病毒性心肌炎的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　 病毒性心肌炎是指由多種病毒感染引起，以心肌細(xì)胞變性、壞死、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤和纖維滲出為主要改變的心肌疾病。其致病病毒以柯薩奇B組病毒（CVB）最為主要，而在CVB的六個血清分型中，CVB3具有強(qiáng)嗜心性，因此，當(dāng)前主要針對CVB3感染建立病毒性心肌炎模型來開展各項研究，本課題選擇病毒性心肌炎作為研究對象的主要原因是，本病自身有很高的危害性，如小兒及成人的各個年齡階段均可累及患病，急性期過后，又有演變?yōu)閿U(kuò)張型心肌病

2、的可能性，同時，也可引起小范圍爆發(fā)流行，而近年病毒性心肌炎的發(fā)病率更是呈現(xiàn)上升趨勢，因此，針對CVB3病毒性心肌炎的治療機(jī)制研究顯得迫在眉睫。
　　 本課題以新生2——3d大鼠體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)建立CVB3感染的VMC模型；通過Hoechst33258熒光檢測心肌細(xì)胞凋亡；免疫組化法檢測心肌細(xì)胞間縫隙連接蛋白Cx43、細(xì)胞骨架-肌動蛋白（actin）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）表達(dá)；透射電鏡觀察CVB3心肌炎細(xì)胞感染模型心肌細(xì)胞功

3、能、形態(tài)學(xué)改變；激光掃描共聚焦顯微鏡實時動態(tài)檢測心肌細(xì)胞游離Ca2+變化及細(xì)胞間縫隙連接通訊功能。試圖驗證益氣活血中藥復(fù)方具有減輕CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞免疫損傷；抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生；調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度；改善細(xì)胞間縫隙連接通訊；修復(fù)心肌細(xì)胞骨架及超微結(jié)構(gòu)的作用，進(jìn)一步證實益氣活血中藥復(fù)方是治療CVB3病毒性心肌炎的有效方劑，益氣活血法是治療本病的有效方法。
　　 材料與方法：
　　 ①益氣活血中藥復(fù)方細(xì)胞毒

4、性測定：取復(fù)蘇的Hela細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)瓶傳代后，以每孔0.2ml接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)Hela細(xì)胞呈單層貼壁生長時，測益氣活血中藥復(fù)方最大無毒劑量。用DMEM培養(yǎng)液將益氣活血中藥復(fù)方注射液從原液開始配制成11個濃度。每孔0．2ml，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)4個加正常生長液的對照孔。分別于24h、48h觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，參考正常對照孔細(xì)胞形態(tài)，以不引起細(xì)胞病變的最大藥物稀釋濃度為最大無毒濃度（TD0

5、）。②CVB3病毒毒力滴定：于96孔培養(yǎng)板中制備單層生長的Hela細(xì)胞，棄去培養(yǎng)板中的生長液，以HBSS液洗滌各培養(yǎng)孔2次。用含2％胎牛血清的維持液，將CVB3病毒以10倍濃度從10-1稀釋到10-8，每孔0．1ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)4個正常對照孔，各加維持液0.1ml，置于37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h、48h觀察細(xì)胞病變情況。③益氣活血中藥復(fù)方對CVB3致心肌細(xì)胞死亡的抑制實驗（MTT法

6、）：取對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，每孔加入0．2ml半數(shù)組織感染量濃度CVB3病毒吸附心肌細(xì)胞2h。吸棄含病毒培養(yǎng)液，以含2％胎牛血清的維持液輕輕洗滌一遍后，加入從藥物最大無毒劑量起始稀釋8個濃度的含益氣活血中藥復(fù)方的生長液，每孔0．2ml，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)1個調(diào)零孔。于48h后，每孔加入0.18ml DMEM培養(yǎng)液，再加入0.02ml MTT溶液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入0.15ml DMSO，置振蕩器上振

7、蕩8min，于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值（OD）。④益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡的影響：正常分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板做細(xì)胞爬片，48h后取單層貼壁生長達(dá)70-80％的正常組、病毒組、中藥干預(yù)組心肌細(xì)胞玻片，以PBS沖洗2次，每孔加入甲醇冰醋酸固定10min，PBS沖洗2次，每孔加入Hoechst33258染色液1ml（5μg/ml），避光反應(yīng)15min，PBS沖洗3次，每次3min

8、，滴加0.05ml抗熒光淬滅封片劑做封片處理，于熒光顯微鏡下觀察。⑤益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞cTnⅠ、Cx43、actin表達(dá)的影響：采用SABC免疫組化法檢測cTnⅠ、Cx43、actin表達(dá)：用3％H2O2孵育長有細(xì)胞的玻片10min，PBS沖洗。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15分鐘，傾去，勿洗。滴加1：100比例稀釋的一抗，37℃溫育2h，PBS沖洗，滴加生物素化二抗，37℃孵育30min。PBS沖洗3次

9、，每次5min。滴加SABC復(fù)合物，37℃濕盒孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明處理，樹脂封片，鏡下觀察。⑥透射電鏡檢測益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響：正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞72h后，用HBSS液沖洗正常組、病毒組、中藥組心肌細(xì)胞，0.25％的胰酶消化3-5min，收集細(xì)胞至1．5mlEP離心管中，1500rpm離心10min，棄上清，以2.5％戊二醛固定

10、，送電鏡檢查。⑦熒光漂白恢復(fù)（FRAP）檢測CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞間縫隙連接通訊功能：于單層貼壁生長達(dá)70-80％的心肌細(xì)胞中，加入以Ca2+、Mg2+PBS配成10μg/ml6-CFDA的應(yīng)用液，于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30min，取出后PBS漂洗后，加入適量含Ca2+、Mg2+的PBS后，上共聚焦顯微鏡檢測。⑧益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞游離鈣濃度的影響：于共聚焦專用培養(yǎng)皿中正常培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞

11、，于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中避光負(fù)載Fluo-3 AM鈣離子熒光探針30min，hanks漂洗后，上共聚焦顯微鏡檢測。
　　 結(jié)果：
　　 ①益氣活血中藥復(fù)方細(xì)胞毒性測定：益氣活血中藥復(fù)方最大無毒劑量為7．813mg/ml。②CVB3病毒毒力滴定：CVB3病毒50％培養(yǎng)細(xì)胞感染量為1×10-4.5。③益氣活血中藥復(fù)方對CVB3致心肌細(xì)胞死亡的抑制實驗（MTT法）：益氣活血中藥復(fù)方最大無毒劑量干預(yù)CVB3攻擊后的心肌細(xì)

12、胞時，其吸光度值亦最大，與其它稀釋度組比較，差異顯著，P<0．001，證實益氣活血中藥復(fù)方最大無毒劑量具有明顯的抑制CVB3致心肌細(xì)胞死亡作用。④益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡的影響：正常組心肌細(xì)胞核呈圓形、卵圓形，未見凋亡細(xì)胞核，而100×鏡下觀察病毒組心肌細(xì)胞核，呈現(xiàn)出成片的亮藍(lán)色，400×鏡下觀察可見細(xì)胞核形態(tài)不完整，呈碎片狀分布，也可見分葉狀細(xì)胞核。中藥組心肌細(xì)胞核多呈圓形，未見明顯的凋亡細(xì)胞核形態(tài)，提示益氣

13、活血中藥復(fù)方可抑制CVB3感染后細(xì)胞凋亡發(fā)生，具有保護(hù)心肌作用。⑤益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞cTnⅠ表達(dá)的影響：免疫組化檢測心肌肌鈣Ⅰ（cTnⅠ）表達(dá)結(jié)果顯示，正常組cTnⅠ未見有明顯陽性棕褐染色。病毒感染組cTnⅠ呈強(qiáng)陽性（+++）表達(dá)，棕褐色陽性信號多且色深，與正常組陽性目標(biāo)平均光密度比較，差異顯著，P<0．05。中藥干預(yù)組cTnⅠ呈弱陽性（+）表達(dá)，水平明顯下降，與病毒組比較，差異顯著，P<0．01。⑥益氣活血

14、中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的影響：免疫組化檢測Connexin43蛋白發(fā)現(xiàn)，正常組心肌細(xì)胞呈強(qiáng)陽性（+++）表達(dá)，而病毒組Cx43呈極弱陽性（±）表達(dá)，與正常組陽性目標(biāo)平均光密度比較，差異極其顯著，P<0.001。中藥治療組Cx43呈陽性（++）表達(dá)，與病毒組比較，差異顯著，P<0.05。⑦益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞actin表達(dá)的影響：免疫組化檢測肌動蛋白（actin）結(jié)果顯示，正常組心肌細(xì)

15、胞actin呈強(qiáng)陽性（+++）表達(dá)。病毒組actin呈弱陽性（+）表達(dá)，與正常組比較，差異顯著，P<0．05。中藥治療組actin呈陽性（++）表達(dá)，與病毒組比較，P<0．01。⑧透射電鏡檢測益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響：CVB3感染組與正常組心肌細(xì)胞相比，細(xì)胞器損傷嚴(yán)重，表明CVB3病毒性心肌炎模型建立成功，而中藥干預(yù)組心肌細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)接近正常組，與模型組比較差異明顯，表明益氣活血中藥復(fù)方能防御

16、并減輕CVB3造成的心肌損傷，具有修復(fù)損傷心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的作用。⑨熒光漂白恢復(fù)（FRAP）檢測CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞間縫隙連接通訊功能：正常心肌細(xì)胞間縫隙連接通訊功能良好，病毒組心肌細(xì)胞漂白后熒光恢復(fù)率顯著低于正常組心肌細(xì)胞，差異明顯，P<0．05，中藥組漂白后熒光恢復(fù)率明顯升高，與病毒組比較差異顯著，P<0．01。⑩益氣活血中藥復(fù)方對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞游離鈣濃度的影響：益氣活血中藥復(fù)方對正常心肌細(xì)胞靜息狀態(tài)內(nèi)鈣無明顯

17、影響，P>0．05，而能提高CVB3攻擊的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，差異明顯，P<0．05。
　　 結(jié)論：
　　 1．以新生大鼠原代心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，成功建立了CVB3攻擊的心肌細(xì)胞感染模型。
　　 2．本實驗從免疫、分子、蛋白及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等層次水平上，揭示益氣活血中藥復(fù)方防治病毒性心肌炎心肌損傷機(jī)制，體現(xiàn)了中醫(yī)藥學(xué)著眼于“整體”的辨治理念。
　　 3．通過對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+、細(xì)胞間縫隙連接