HGT免疫抗炎活性部位的篩選及其免疫藥理學(xué)初步研究.pdf

1、目的：從HGT中分離篩選免疫抗炎活性部位，探討其對(duì)實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的治療作用及其機(jī)理，為研制和開發(fā)治療RA的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：應(yīng)用巴豆油誘發(fā)的小鼠急性耳腫脹及二硝基氯苯(DNCB)誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)作為免疫抗炎活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察對(duì)急性炎癥及細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。應(yīng)用佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型，通過觀察足爪腫脹和踝關(guān)節(jié)組織病理變化評(píng)價(jià)對(duì)RA的治療作用；應(yīng)

2、用ELISA法測(cè)定血清中白三烯(LTB<,4>)水平、紫外分光光度法測(cè)定足爪浸泡液中前列腺素E2(PGE<,2>)含量的變化，觀察對(duì)炎癥介質(zhì)水平的影響；通過<'3>H-TdR摻入法測(cè)定脾細(xì)胞增殖反應(yīng)、ELISA法測(cè)定脾細(xì)胞分泌抗體IgG水平、Luminex技術(shù)測(cè)定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-4水平以及應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定小鼠T細(xì)胞亞群和T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，觀察對(duì)免疫反應(yīng)的影響。 結(jié)果： (1)HGT四

3、個(gè)提取部位HGT-1、HGT-2、HGT-3和HGT-5均有一定的抗炎和免疫抑制作用，綜合溶解度和可能的毒性等各方面因素，選定了HGT-5進(jìn)行了進(jìn)一步分離純化，經(jīng)活性評(píng)價(jià)確定了其中分子量較大的多糖部位為主要免疫抗炎活性部位，隨后將HGT-5用80％乙醇沉淀得到了目標(biāo)部位HGT-5A。 (2)HGT-5A在100～500mg/kg灌胃給藥對(duì)巴豆油誘發(fā)的小鼠急性耳腫脹具有明顯的抑制作用，在50～100mg/kg灌胃給藥對(duì)DNCB誘導(dǎo)

4、的DTH反應(yīng)具有明顯的抑制作用，并且對(duì)DTH模型小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)具有明顯的抑制作用；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HGT-5A在1～500μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG含量具有濃度依賴性的抑制作用，且無明顯的細(xì)胞毒性；僅在1000μg/mL時(shí)具有一定的細(xì)胞毒性。 (3)HGT-5A在30和60mg/kg灌胃給藥2w可明顯抑制AA大鼠原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足爪腫脹，改善關(guān)節(jié)組織病理變化，并增強(qiáng)AA大鼠降低的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)

5、，減少AA大鼠升高的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IgG含量，同時(shí)減少關(guān)節(jié)組織中PGE2的含量，而對(duì)血清中LTB<,4>作用不明顯，提示HGT-5A對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，該作用可能與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制PGE<,2>炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。 (4)HGT-5A在100和250mg/kg灌胃給藥40d可明顯減輕CIA小鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹，改善踝關(guān)節(jié)的組織病理變化，并降低血清Ⅱ型膠原抗體水平，降低T細(xì)胞亞群CD4<'+>/CD8<'+>比值，增加T調(diào)節(jié)

6、細(xì)胞(Treg)百分率，降低脾細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α等炎性因子水平，降低Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ和Th2細(xì)胞分泌的IL-4，其中以降低Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ為主，從而恢復(fù)Th1/Th2平衡。提示HGT-5A對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)炎具有治療作用，該作用可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫的平衡，從而抑制Ⅱ型膠原抗體和炎性因子的產(chǎn)生有關(guān)。 (5)化學(xué)分析結(jié)果表明，HGT-5A的主要成分為多糖；應(yīng)用DEAE-纖維素柱層析和凝膠柱層析從HGT