豬IL-6對關(guān)鍵藥物代謝酶CYP2C33的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450(cytochromeP450或CYP450)是由許多同工酶組成的人和動物體內(nèi)重要的藥物代謝酶超家族，涉及內(nèi)源性和外源性物質(zhì)以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝，另一方面，內(nèi)源性物質(zhì)以及外源性物質(zhì)同樣能夠影響細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)。CYP2C33是豬體內(nèi)重要的藥物代謝酶之一，是人CYP2C家族的研究模型。IL-6(interleukin-6)是一種引起肝臟炎癥反應(yīng)以及腫瘤病變最重要的細(xì)胞因子之一，且IL-6具有免疫調(diào)節(jié)作用

2、，作為免疫佐劑和免疫增強劑被應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。但其對相關(guān)藥物代謝酶表達(dá)的影響并不清楚，而藥物代謝酶表達(dá)的變化嚴(yán)重影響臨床藥物的療效、毒性作用以及藥物與藥物間的相互作用。本研究首次探討豬IL-6對CYP2C33的表達(dá)調(diào)控及其相關(guān)的分子機制，為IL-6對CYP450表達(dá)調(diào)控研究提供理論基礎(chǔ)，同時為獸醫(yī)及臨床醫(yī)學(xué)上的合理用藥提供理論指導(dǎo)。
　　1.各種不同細(xì)胞色素P450在組織中的分布
　　用qRT-PCR的方法檢測不同組織中（

3、心、肝、腎臟、小腸、肌肉、脾臟、皮膚、肺）細(xì)胞色素P450 mRNA的分布情況，結(jié)果顯示，肝臟中CYP1A，CYP2C，CYP2D，CYP2E，CYP3A mRNA水平明顯高于其他組織，而肝臟中含量最高的是CYP3A類藥物代謝酶，其次則為CYP2C。該實驗證明I相代謝主要集中于肝臟組織，因此后續(xù)實驗在細(xì)胞水平研究細(xì)胞色素P450應(yīng)在肝臟原代細(xì)胞水平和肝臟傳代細(xì)胞水平研究。而在肝臟中含量最高的則是CYP3A類及CYP2C類藥物代謝酶，這為

4、后續(xù)的研究提供了一定的基礎(chǔ)。
　　2.原代豬肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　利用不同方法獲得了高活性的豬原代肝細(xì)胞，最終確定其最佳的方法為:采用PBE，PB，PBC三步灌流方法，最佳膠原酶灌流濃度為0.05％，最佳的包被方式為鼠尾膠原包被法。通過實驗獲得的豬肝細(xì)胞高達(dá)3X109個，存活率99.9％，細(xì)胞在培養(yǎng)5小時后開始貼壁分化，并在12小時細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，有較好的結(jié)構(gòu)功能，通過測定相關(guān)藥物代謝酶的mRNA水平與肝組織的較為相近，可用于

5、IL-6的研究。
　　3.IL-6在細(xì)胞水平對豬細(xì)胞色素酶CYP2C33表達(dá)的影響
　　為了檢測IL-6對豬細(xì)胞色素酶CYP2C33表達(dá)的影響，在不同時間點用不同濃度梯度的IL-6作用豬原代肝細(xì)胞和傳代細(xì)胞系HepLi，應(yīng)用qRT-PCR和Western-blot的方法檢測了肝臟細(xì)胞中IL-6對CYP2C33的表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示IL-6能顯著性上調(diào)CYP2C33的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的時間和劑量相關(guān)性。
　　4.IL-

6、6從轉(zhuǎn)錄水平上對CYP2C33表達(dá)調(diào)控
　　通過轉(zhuǎn)錄抑制實驗，證明了IL-6是從轉(zhuǎn)錄水平上對CYP2C33的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的。構(gòu)建含有不同長度CYP2C33啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同長度的CYP2C33啟動子片段，發(fā)現(xiàn)CYP2C33的核心啟動子區(qū)域位于CYP2C33轉(zhuǎn)錄起始位點上游-2424到-1593區(qū)域，并且下游第一個內(nèi)含子區(qū)域?qū)ι嫌螁幼踊钚杂幸欢ǖ脑鰪娮饔?，通過用IL-6刺激其核心啟動子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)IL-6能激

7、活CYP2C33的核心啟動子區(qū)域。因此提示IL-6對CYP2C33的表達(dá)調(diào)控是從轉(zhuǎn)錄水平上對其發(fā)揮作用的。
　　5.IL-6對核受體PXR，CAR，RXR-α表達(dá)的影響
　　分別用不同濃度的IL-6在不同時間分別作用豬原代肝細(xì)胞和傳代細(xì)胞系HepLi，應(yīng)用qRT-PCR和Western-blot檢測了肝臟細(xì)胞中核受體PXR，CAR，RXR-α的表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示IL-6對RXR-α的表達(dá)并沒有顯著影響。而IL-6能顯著性

8、上調(diào)CAR和PXR的表達(dá)，CAR和PXR的變化趨勢與CYP2C33變化趨勢有相關(guān)性，且呈現(xiàn)一定的時間和劑量相關(guān)性。
　　6.IL-6對CYP2C33表達(dá)機制的研究
　　通過RACE的方法獲得全長的RXR-α的序列，構(gòu)建PXR，CAR以及RXR-α的真核表達(dá)質(zhì)粒，用細(xì)胞轉(zhuǎn)染PXR，CAR和RXR-α的真核表達(dá)質(zhì)粒以及siPXR，siCAR，siRXR-α超表達(dá)或干擾相關(guān)核受體的表達(dá)，探討IL-6上調(diào)CYP2C33表達(dá)的分子機制