抗菌肽Cecropin B對豬關鍵藥物代謝酶CYP3A29的表達調(diào)控及分子機制研究.pdf

1、抗菌肽已作為獸藥和飼料添加劑廣泛應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。然而，目前關于抗菌肽等生物藥物對藥物代謝酶的表達調(diào)控研究十分有限，導致聯(lián)合用藥過程中出現(xiàn)療效欠佳、安全性下降等問題。隨著抗菌肽的不斷開發(fā)應用，了解和研究其對細胞色素P450酶(Cytochrome P450)的影響具有重要的意義。CYP3A29是豬體內(nèi)最重要的細胞色素P450酶，含量約占機體總P450酶含量的30％左右，代謝超過50％的外源性物質(zhì)，其活性的微小變化都將影響藥物的療效，結(jié)構(gòu)

2、及代謝特征與人CYP3A4相似，已被證明是CYP3A4的重要研究模型。本研究發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽Cecropin B通過TLRs(Toll-likereceptors)進行跨膜信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NFκB及下游核受體PXR(PregnaneX Receptor)、RXR-α(Retinoid X Receptorα)，從而調(diào)控豬CYP3A29的表達。該研究結(jié)果將為獸醫(yī)及人醫(yī)臨床合理用藥及更好的應用抗菌肽等生物藥物提供理論指導及分子基礎。本

3、課題取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.Cecropin B對CYP3A29及PXR、RXR-α的表達調(diào)控作用研究
　　為了檢測CecropinB對CYP3A29及PXR、RXR-α的表達的影響，通過RT-PCR、Western Blot檢測了豬肝臟原代細胞和傳代細胞系HepLi中CecropinB在不同時間及不同劑量條件下對CYP3A29及PXR、RXR-α的表達量的影響，結(jié)果表明:Cecropin B在一定濃度和時間范圍內(nèi)

4、能顯著抑制CYP3A29及PXR的表達，且兩者之間的變化趨勢具有相關性，提示CYP3A29的表達與PXR有關;Cecropin B對核受體RXR-α的表達無影響。
　　為了驗證PXR、RXR-α在CecropinB抑制CYP3A29表達過程中是否發(fā)揮作用，采用PXR超表達試驗及PXR的SiRNA干擾試驗驗證了Cecropin B通過抑制PXR的表達來抑制CYP3A29的表達;通過Western Blot對RXR-α的蛋白分布進行檢

5、測及通過RXR-α的SiRNA干擾試驗驗證了CecropinB通過誘導RXR-α蛋白出核從而抑制由PXR介導的CYP3A29的表達。該部分結(jié)果表明Cecropin B對CYP3A29的抑制作用是由PXR、RXR-α共同介導的。
　　2.Cecropin B對CYP3A29啟動子水平的調(diào)控作用研究
　　為了從轉(zhuǎn)錄水平上分析核受體PXR、RXR-α介導的Cecropin B對CYP3A29的表達調(diào)控作用，進行了以下試驗:通過轉(zhuǎn)錄

6、抑制試驗證明了Cecropin B對CYP3A29的表達調(diào)控是從啟動子水平上實現(xiàn)的;構(gòu)建CYP3A29的啟動子報告質(zhì)粒，雙熒光試驗檢測發(fā)現(xiàn)Cecropin B能夠抑制其活性;通過JASPAR軟件預測CYP3A29啟動子區(qū)存在PXR/RXR-α二聚體結(jié)合位點，對預測位點進行定點突變試驗及染色質(zhì)免疫共沉淀試驗，在CYP3A29的啟動子區(qū)確定了PXR/RXR-α二聚體的結(jié)合位點。該部分結(jié)果表明Cecropin B通過抑制PXR/RXR-α二聚

7、體對CYP3A29啟動子的結(jié)合而抑制CYP3A29的轉(zhuǎn)錄。
　　3.Cecropin B對NF-κB/PXR的激活作用研究
　　為了檢測核受體PXR/RXR-α二聚體上游信號對PXR的調(diào)控，分析了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮的作用，得到的結(jié)果如下:通過轉(zhuǎn)染NF-κB p65超表達質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)NF-κBp65具有抑制CYP3A29和PXR的表達的作用;轉(zhuǎn)染NF-κB p65報告質(zhì)粒，并用Cecropin B刺激細胞，發(fā)現(xiàn)Cecropin

8、 B激活了NF-κB p65;用NF-κB抑制劑BAY117082抑制HepLi細胞內(nèi)NF-κB核轉(zhuǎn)位之后，Cecropin B對CYP3A29和PXR的作用消失;HepLi細胞轉(zhuǎn)染NF-κBp65-EGFP發(fā)光質(zhì)粒后用CecropinB刺激細胞，發(fā)現(xiàn)NF-κB p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。上述結(jié)果表明NF-κB被激活，表達量升高，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，抑制PXR、CYP3A29的表達。
　　構(gòu)建PXR的啟動子報告質(zhì)粒，通過JASPAR軟件預

9、測、染色質(zhì)免疫共沉淀試驗（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）在PXR的啟動子區(qū)找到了NF-κB的結(jié)合位點，表明NF-κB對PXR具有轉(zhuǎn)錄抑制的作用。該部分結(jié)果表明Cecropin B通過激活NF-κB抑制PXR的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控CYP3A29的表達。
　　4.Cecropin B對NF-κB/RXR-α的激活作用的研究
　　在已知NF-κB通過抑制PXR啟動子活性來調(diào)控CYP3A29表達的基礎

10、上，結(jié)合RXR-α的出核現(xiàn)象，并通過免疫共沉淀試驗（Co-Immunoprecipitation，CoIP）檢測到NF-κB能夠結(jié)合RXR-α，提示CecropinB能使NF-κB與PXR競爭性結(jié)合RXR-α，使其出核，抑制PXR/RXR-α二聚體的形成。該部分結(jié)果表明Cecropin B通過第二條信號通路即NF-κB/RXR-α信號通路調(diào)控CYP3A29的表達。
　　5.CecropinB對TLRs/NF-κB的激活作用的研究<

11、br>　　為了檢測Cecropin B的跨膜信號轉(zhuǎn)導作用，設計合成TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6干擾分子，轉(zhuǎn)染HepLi細胞后用Cecropin B刺激，熒光定量檢測CYP3A29和PXR的表達，發(fā)現(xiàn)干擾了TLR2、TLR4、TLR5之后，CecropinB對CYP3A29的作用被削弱;TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6干擾分子與NF-κB p65報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepLi細胞后用Cecropin B刺激，