抗菌肽Cecropin B對(duì)豬關(guān)鍵藥物代謝酶CYP3A29的表達(dá)調(diào)控及分子機(jī)制研究.pdf

1、抗菌肽已作為獸藥和飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。然而，目前關(guān)于抗菌肽等生物藥物對(duì)藥物代謝酶的表達(dá)調(diào)控研究十分有限，導(dǎo)致聯(lián)合用藥過程中出現(xiàn)療效欠佳、安全性下降等問題。隨著抗菌肽的不斷開發(fā)應(yīng)用，了解和研究其對(duì)細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450)的影響具有重要的意義。CYP3A29是豬體內(nèi)最重要的細(xì)胞色素P450酶，含量約占機(jī)體總P450酶含量的30％左右，代謝超過50％的外源性物質(zhì)，其活性的微小變化都將影響藥物的療效，結(jié)構(gòu)

2、及代謝特征與人CYP3A4相似，已被證明是CYP3A4的重要研究模型。本研究發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽Cecropin B通過TLRs(Toll-likereceptors)進(jìn)行跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NFκB及下游核受體PXR(PregnaneX Receptor)、RXR-α(Retinoid X Receptorα)，從而調(diào)控豬CYP3A29的表達(dá)。該研究結(jié)果將為獸醫(yī)及人醫(yī)臨床合理用藥及更好的應(yīng)用抗菌肽等生物藥物提供理論指導(dǎo)及分子基礎(chǔ)。本

3、課題取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.Cecropin B對(duì)CYP3A29及PXR、RXR-α的表達(dá)調(diào)控作用研究
　　為了檢測(cè)CecropinB對(duì)CYP3A29及PXR、RXR-α的表達(dá)的影響，通過RT-PCR、Western Blot檢測(cè)了豬肝臟原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞系HepLi中CecropinB在不同時(shí)間及不同劑量條件下對(duì)CYP3A29及PXR、RXR-α的表達(dá)量的影響，結(jié)果表明:Cecropin B在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)

4、能顯著抑制CYP3A29及PXR的表達(dá)，且兩者之間的變化趨勢(shì)具有相關(guān)性，提示CYP3A29的表達(dá)與PXR有關(guān);Cecropin B對(duì)核受體RXR-α的表達(dá)無影響。
　　為了驗(yàn)證PXR、RXR-α在CecropinB抑制CYP3A29表達(dá)過程中是否發(fā)揮作用，采用PXR超表達(dá)試驗(yàn)及PXR的SiRNA干擾試驗(yàn)驗(yàn)證了Cecropin B通過抑制PXR的表達(dá)來抑制CYP3A29的表達(dá);通過Western Blot對(duì)RXR-α的蛋白分布進(jìn)行檢

5、測(cè)及通過RXR-α的SiRNA干擾試驗(yàn)驗(yàn)證了CecropinB通過誘導(dǎo)RXR-α蛋白出核從而抑制由PXR介導(dǎo)的CYP3A29的表達(dá)。該部分結(jié)果表明Cecropin B對(duì)CYP3A29的抑制作用是由PXR、RXR-α共同介導(dǎo)的。
　　2.Cecropin B對(duì)CYP3A29啟動(dòng)子水平的調(diào)控作用研究
　　為了從轉(zhuǎn)錄水平上分析核受體PXR、RXR-α介導(dǎo)的Cecropin B對(duì)CYP3A29的表達(dá)調(diào)控作用，進(jìn)行了以下試驗(yàn):通過轉(zhuǎn)錄

6、抑制試驗(yàn)證明了Cecropin B對(duì)CYP3A29的表達(dá)調(diào)控是從啟動(dòng)子水平上實(shí)現(xiàn)的;構(gòu)建CYP3A29的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，雙熒光試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cecropin B能夠抑制其活性;通過JASPAR軟件預(yù)測(cè)CYP3A29啟動(dòng)子區(qū)存在PXR/RXR-α二聚體結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)預(yù)測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)及染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)，在CYP3A29的啟動(dòng)子區(qū)確定了PXR/RXR-α二聚體的結(jié)合位點(diǎn)。該部分結(jié)果表明Cecropin B通過抑制PXR/RXR-α二聚

7、體對(duì)CYP3A29啟動(dòng)子的結(jié)合而抑制CYP3A29的轉(zhuǎn)錄。
　　3.Cecropin B對(duì)NF-κB/PXR的激活作用研究
　　為了檢測(cè)核受體PXR/RXR-α二聚體上游信號(hào)對(duì)PXR的調(diào)控，分析了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮的作用，得到的結(jié)果如下:通過轉(zhuǎn)染NF-κB p65超表達(dá)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)NF-κBp65具有抑制CYP3A29和PXR的表達(dá)的作用;轉(zhuǎn)染NF-κB p65報(bào)告質(zhì)粒，并用Cecropin B刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Cecropin

8、 B激活了NF-κB p65;用NF-κB抑制劑BAY117082抑制HepLi細(xì)胞內(nèi)NF-κB核轉(zhuǎn)位之后，Cecropin B對(duì)CYP3A29和PXR的作用消失;HepLi細(xì)胞轉(zhuǎn)染NF-κBp65-EGFP發(fā)光質(zhì)粒后用CecropinB刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NF-κB p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。上述結(jié)果表明NF-κB被激活，表達(dá)量升高，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，抑制PXR、CYP3A29的表達(dá)。
　　構(gòu)建PXR的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，通過JASPAR軟件預(yù)

9、測(cè)、染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）在PXR的啟動(dòng)子區(qū)找到了NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，表明NF-κB對(duì)PXR具有轉(zhuǎn)錄抑制的作用。該部分結(jié)果表明Cecropin B通過激活NF-κB抑制PXR的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控CYP3A29的表達(dá)。
　　4.Cecropin B對(duì)NF-κB/RXR-α的激活作用的研究
　　在已知NF-κB通過抑制PXR啟動(dòng)子活性來調(diào)控CYP3A29表達(dá)的基礎(chǔ)

10、上，結(jié)合RXR-α的出核現(xiàn)象，并通過免疫共沉淀試驗(yàn)（Co-Immunoprecipitation，CoIP）檢測(cè)到NF-κB能夠結(jié)合RXR-α，提示CecropinB能使NF-κB與PXR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RXR-α，使其出核，抑制PXR/RXR-α二聚體的形成。該部分結(jié)果表明Cecropin B通過第二條信號(hào)通路即NF-κB/RXR-α信號(hào)通路調(diào)控CYP3A29的表達(dá)。
　　5.CecropinB對(duì)TLRs/NF-κB的激活作用的研究<

11、br>　　為了檢測(cè)Cecropin B的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，設(shè)計(jì)合成TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6干擾分子，轉(zhuǎn)染HepLi細(xì)胞后用Cecropin B刺激，熒光定量檢測(cè)CYP3A29和PXR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾了TLR2、TLR4、TLR5之后，CecropinB對(duì)CYP3A29的作用被削弱;TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6干擾分子與NF-κB p65報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepLi細(xì)胞后用Cecropin B刺激，