線粒體融合蛋白2與胰島素抵抗的關(guān)系及其機(jī)制研究.pdf

1、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn2)是由我國學(xué)者陳光慧教授于1997年首先發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與高血壓有關(guān)的新基因。該基因在正常大鼠血管平滑肌中高表達(dá)，而在自發(fā)性高血壓大鼠的血管平滑肌中低表達(dá)，最初該基因被命名為高血壓相關(guān)基因(hypertension related gene，HRG)。后來發(fā)現(xiàn)該基因產(chǎn)物可以抑制Ras-raf-ERK-MAPK途徑，從而有效地阻遏細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞增殖，遂更名為增殖抑制基因(hyperplasi

2、a suppressor gene，HSG)。后來證明該基因產(chǎn)物可以促進(jìn)線粒體的融合，遂更名為線粒體融合蛋白2基因。Mfn2不僅在血管平滑肌中表達(dá)，在心、腦、肺、腎、肝、骨胳肌、棕色脂肪組織中表達(dá)量也很高，其中以心肌、骨骼肌、棕色脂肪組織中表達(dá)量最高，在腦、腎、肝、肺、睪丸表達(dá)量稍次。 代謝綜合征的各種病理機(jī)制中，氧化應(yīng)激是一個(gè)重要的方面，氧化應(yīng)激在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，許多代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的出現(xiàn)，都與氧化應(yīng)激

3、所致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。線粒體是氧化應(yīng)激各活性分子產(chǎn)生的一個(gè)主要場所，也是介導(dǎo)凋亡的主要效應(yīng)細(xì)胞器。已有初步的證據(jù)表明Mfn2參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是它在其中的作用，仍有爭論，一部分學(xué)者認(rèn)為Mfn2是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；另外有學(xué)者認(rèn)為Mfn2具有抗凋亡的作用，是在凋亡刺激因素下誘導(dǎo)表達(dá)的保護(hù)性分子，本課題第二部分試圖澄清這一爭論。同時(shí)我們考慮到，代謝綜合征具有明顯的遺傳傾向，多種基因與肥胖、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化性

4、心臟病、高脂血癥等疾病具有明顯的相關(guān)性。對于我們關(guān)注的Mfn2基因，是否存在突變位點(diǎn)或多態(tài)性位點(diǎn)，從而導(dǎo)致其表達(dá)升高或降低，或者功能出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致某類代謝綜合征如糖尿病的易感性，是本課題第三部分關(guān)注的問題。 本課題三部分的具體內(nèi)容如下： 第一部分胰島素抵抗及羅格列酮干預(yù)大鼠骨骼肌PGC-1α和Mfn2基因的表達(dá)變化 目的：通過對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PGC-1α和Mfn2基因表達(dá)和線粒體形態(tài)的研究

5、，了解PGC-1α和Mfn2與胰島素抵抗發(fā)生的相關(guān)性；并通過羅格列酮的干預(yù)，觀察羅格列酮對PGC-1α租Mfn2的表達(dá)和線粒體形態(tài)的影響。 方法：成年Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組(NC)、高脂組(HF)和高脂羅格列酮干預(yù)組(HF+RSG)。對照組給予普通飼料，其余兩組給予高脂飼料。喂養(yǎng)4周時(shí)，大鼠心臟采血用于生化指標(biāo)的檢測。清醒狀態(tài)下用正常葡萄糖高胰島素鉗夾技術(shù)評價(jià)檢測各組葡萄糖輸注率，評價(jià)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。高脂飲食的兩組大鼠胰

6、島素抵抗?fàn)顟B(tài)形成。羅格列酮干預(yù)組增加羅格列酮灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水。第8周時(shí)，大鼠心臟采血用于生化指標(biāo)的檢測。清醒狀態(tài)下用正常葡萄糖高胰島素鉗夾技術(shù)檢測各組葡萄糖輸注率，再次評價(jià)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。動物放血處死取材，快速凍于液氮，儲存于-70℃冰箱中。實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測骨骼肌PGC-1α和Mfn2的表達(dá)；透射電鏡觀察骨骼肌線粒體的形態(tài)變化；Image-Pro Plus 6軟件分析電鏡照片中線粒體形態(tài)的各項(xiàng)參

7、數(shù)。 結(jié)果：1.高脂飲食4周，大鼠葡萄糖輸注率降低，胰島素抵抗大鼠模型成功；羅格列酮可改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。 2.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，正常對照組和高脂羅格列酮干預(yù)組骨骼肌PGC-lα mRNA拷貝數(shù)沒有顯著差異，而高脂組拷貝數(shù)明顯減少，與正常對照組和高脂羅格列酮干預(yù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mfn2 mRNA的拷貝數(shù)，正常對照組最高，高脂組最低，高脂羅格列酮干預(yù)組處于二者之間，三組之間的差

8、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3.Western印跡顯示，正常對照組和高脂羅格列酮干預(yù)組骨骼肌PGC-lα蛋白的表達(dá)沒有顯著差異，而高脂組表達(dá)量明顯減少，高脂組與正常對照組和高脂羅格列酮干預(yù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mfn2蛋白的表達(dá)，正常對照組最高，高脂組最低，高脂羅格列酮干預(yù)組處于二者之間，三組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4.透射電鏡觀察表明，與正常對照組相比，高脂組肌纖維間線粒

9、體體型明顯減小，比較細(xì)碎。而在肌膜下則分布眾多體型較大的線粒體，且線粒體常常出現(xiàn)髓樣化、致密化或腫脹等代謝障礙的典型現(xiàn)象。電鏡照片經(jīng)Image-Pro Plus 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，高脂組的線粒體面積、直徑及線粒體占肌纖維體積百分比均明顯下降(P<0.05)，而高脂羅格列酮干預(yù)組各項(xiàng)指標(biāo)與正常對照組相比無明顯差異。 第二部分Mfn2對氧化應(yīng)激所致細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制 目的：為了探討Mfn2對線

10、粒體氧化還原功能的影響，本部分用野生型(pEGFP-Mfn2質(zhì)粒)和顯性激活突變型(pEGFP-Mfn2G12V質(zhì)粒)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，然后用半致死劑量的H2O2處理細(xì)胞，觀察Mfn2及其突變形式在氧化應(yīng)激所致細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。 方法：1.不同濃度H2O2對細(xì)胞凋亡的影響：用含10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入H2O2，設(shè)置不同的濃度梯度。孵育2小時(shí)。更換新鮮培養(yǎng)基

11、，繼續(xù)培養(yǎng)24h。每孔加入10μl CCK-8溶液以檢測細(xì)胞活性，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時(shí)，用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度。確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最適H2O2濃度N。 2.不同濃度H2O2對Mfn2表達(dá)的影響：基本步驟同前，細(xì)胞接種6孔板。加入H2O2，使終濃度分別為0、1/2N、N、2N μmol/L。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western印跡分析。 3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率觀察：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、提取及酶切鑒定依常規(guī)方法進(jìn)行。細(xì)胞接

12、種6孔板，設(shè)置不同的質(zhì)粒濃度，使用梭華-SofastTM轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，利用質(zhì)粒攜帶的綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。 4.CCK-8試驗(yàn)：細(xì)胞分為4組，分別為：未處理組(轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空質(zhì)粒，不加H2O2處理)、空質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空質(zhì)粒，加H2O2處理)、Mfn2組(轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2質(zhì)粒，加H2O2處理)、Mfn2 G12V組(轉(zhuǎn)染pEGFP-Mfn2G

13、12V質(zhì)粒，加H2O2處理)。用CCK-8試驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞活性。 5.Hoechst染色：方法及分組同上，通過Hoechst 33258染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。 6.Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞檢測：方法及分組同前，細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。 7.線粒體膜電位檢測：方法及分組同前，細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后，用流式細(xì)胞儀分析紅綠熒光所占

14、的比率。 8.caspase-3活性檢測：方法及分組同前，各組細(xì)胞中加入caspase-3的底物AC-DEVD-pNA，使其終濃度為50 μmol/L，反應(yīng)后采用酶標(biāo)免疫測定儀測定波長405nm下的吸光度值，以此表示caspase-3的相對活性。 9.Western印跡檢測：方法及分組同前，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western印跡分析。檢測蛋白為：Mfn2、Cyt c、Bcl-2和Bax。 第三部分Mfn2啟動子區(qū)

15、PGC-lα及ERRα順式作用元件的多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性分析 目的：為了尋找Mfn2與糖尿病發(fā)生相關(guān)的進(jìn)一步證據(jù)，本部分通過篩查Mfn2的啟動子區(qū)PGC-lα和ERRα的順式作用元件附近，是否存在多態(tài)性位點(diǎn)，比較研究這些多態(tài)性位點(diǎn)與臨床糖尿病發(fā)生的相關(guān)性。 方法：選取確診的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)住院病人100例，另選取年齡、性別相匹配的健康體檢者112例，取4ml

16、EDTA-K2抗凝血，一部分進(jìn)行常規(guī)生化檢驗(yàn)，一部分提取基因組DNA。在Mfn2的啟動子區(qū)PGC-lα和ERRα的順式作用元件附近設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增，用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析的方法來篩選差異個(gè)體。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件與GenBank公布的Mfn2(NM 014874)啟動子區(qū)序列進(jìn)行比對，找出多態(tài)性位點(diǎn)。運(yùn)用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因頻率及等位基因頻率，運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群

17、體代表性。χ2檢驗(yàn)分析多態(tài)性位點(diǎn)的分布在2型糖尿病組和健康對照組之間是否存在差異。 綜合上述三部分內(nèi)容，本研究得出如下結(jié)論： 1長期高脂飲食，可引起PGC-1α和Mfn2基因表達(dá)活性下降和線粒體形態(tài)異常，這些變化參與了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的形成。羅格列酮改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的機(jī)制，可能與羅格列酮調(diào)節(jié)PGC-lα和Mfn2兩基因的表達(dá)、維持正常線粒體的形態(tài)及功能有關(guān)。 2在本課題所選擇的H2O2濃度范圍下，Mfn2針對H2