電針對(duì)化療及炎癥相關(guān)疼痛的作用及機(jī)制.pdf

1、背景：
　　 針灸在中國(guó)以及其他亞洲國(guó)家的應(yīng)用已有兩千多年的歷史，疼痛是針灸的主要適應(yīng)癥之一。早期研究證實(shí)，針灸對(duì)腰背痛、膝關(guān)節(jié)痛等有較好療效。一個(gè)小型臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針灸亦可改善腫瘤患者化療相關(guān)的神經(jīng)痛癥狀。針灸鎮(zhèn)痛的機(jī)制尚未完全明了，目前，研究比較明確的是，阿片類受體是針灸鎮(zhèn)痛的主要靶點(diǎn)之一，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，μ和δ阿片類受體參與介導(dǎo)電針(EA)治療完全弗氏佐劑(CFA)和辣椒素誘導(dǎo)的炎性疼痛以及大鼠尾干受傷引起的神經(jīng)痛，因此

2、，電針亦有可能通過阿片類受體治療化療相關(guān)神經(jīng)痛。另一方面，研究數(shù)據(jù)證實(shí)，針灸可有效治療炎性疼痛，脊髓腰膨大膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能是其起效靶點(diǎn)之一，并且脊髓腰膨大星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化被認(rèn)為與炎性疼痛密切相關(guān)。白細(xì)胞介素17(IL-17)是最新發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞因子，一般認(rèn)為，其主要由TH17細(xì)胞分泌，并且主要介導(dǎo)自身免疫性疾病，最近的研究提示，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞中亦可觀察到IL-17的表達(dá)，另有研究表明，外周IL-17可介

3、導(dǎo)關(guān)節(jié)及神經(jīng)痛，因此，脊髓腰膨大的膠質(zhì)細(xì)胞中亦可能存在IL-17表達(dá)，并且其很可能與炎性疼痛相關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，脊髓腰膨大膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-1β等細(xì)胞因子參與介導(dǎo)針灸鎮(zhèn)痛。以此類推，如果脊髓IL-17參與介導(dǎo)炎性疼痛，那么，這種細(xì)胞因子也可能介導(dǎo)針灸鎮(zhèn)痛。
　　 目的：
　　 第一，研究針灸是否可以抑制化療相關(guān)神經(jīng)痛以及阿片類受體是否參與介導(dǎo)針灸治療化療痛；第二，觀察炎性痛大鼠模型脊髓細(xì)胞是否表達(dá)IL-17，如果表

4、達(dá)，IL-17是否參與介導(dǎo)炎性疼痛，以及IL-17是否介導(dǎo)針灸鎮(zhèn)痛。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)共分為七個(gè)部分，一、電針對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的化療痛的干預(yù)作用；二、阿片類受體在電針治療化療相關(guān)疼痛中的作用；三、免疫組化法檢測(cè)IL-17及其受體在炎性痛模型大鼠脊髓中的表達(dá)；四、IL-17抗血清對(duì)炎性痛模型大鼠熱縮足閾值的影響及其對(duì)IL-17RA的表達(dá)和NR1磷酸化的調(diào)控作用；五、IL-17蛋白椎管注射對(duì)正常大鼠腳掌熱縮足閾值的影響及

5、其對(duì)IL-17RA的表達(dá)和NR1磷酸化的調(diào)控作用；六、電針對(duì)CFA誘導(dǎo)的痛覺過敏的作用以及電針對(duì)的脊髓IL-17、IL-17RA、p-NR1表達(dá)的影響；七、電針對(duì)IL-17誘導(dǎo)的痛覺過敏的作用及機(jī)制
　　 實(shí)驗(yàn)一，動(dòng)物隨機(jī)分為4組，即模型+假電針組(paclitaxei+shamEA)，模型+高頻電針組(paclitaxel+100Hz)，模型+低頻電針組(paclitaxel+10HzEA)，模型對(duì)照+假電針組(vehicle

6、+shamEA)，每組7只。分別于紫杉醇注射前、注射后第13天(電針前)，注射后第14、16、18、20天(每次電針后30分鐘)，采用2、4、6和15g弗萊毛檢測(cè)大鼠的機(jī)械縮足閾值。
　　 實(shí)驗(yàn)二，紫杉醇腹腔注射后的動(dòng)物隨機(jī)分為8組，即生理鹽水+電針組(paclitaxel+Vehicle+EA)，生理鹽水+假電針組(paclitaxel+Vehicle+sham)，CTOP+電針組(paclitaxel+CTOP+EA)，CT

7、OP+假電針組(paclitaxel+CTOP+Sham)，Naltrindole+電針組(paclitaxel+Naltrindole+EA)，Naltrindole+假電針組(paclitaxel+Naltrindole+Sham)，nor-BNI+電針組(paclitaxel+nor-BNI+EA)，nor-BNI+假電針組(paclitaxel+nor-BNI+Sham)，每組7只。三種受體阻滯劑均溶于生理鹽水，于紫杉醇注射后1

8、4、16、18和20天進(jìn)行脊髓給藥，給藥后10分鐘實(shí)施電針。行為學(xué)測(cè)試同實(shí)驗(yàn)一。
　　 實(shí)驗(yàn)三，免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)模型鼠IL-17的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)部分，1、CFA腳掌注射后的大鼠被隨機(jī)分為注射后2小時(shí)和24小時(shí)組，每組3只，另外3只大鼠作為對(duì)照組，于腳掌注射生理鹽水24小時(shí)后取材。大鼠脊髓腰膨大被用作免疫熒光染色，進(jìn)行IL-17的計(jì)數(shù)和定位(與星狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物OX-42和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物NeuN

9、雙標(biāo))；2、取CFA24小時(shí)組的脊髓腰膨大切片，免疫熒光雙標(biāo)IL-17RA和NR1，觀察IL-17RA是否表達(dá)在含NMDAR的神經(jīng)細(xì)胞上。
　　 實(shí)驗(yàn)四，觀察IL-17抗血清是否可以緩解CFA引起的炎性疼痛。CFA或生理鹽水同時(shí)分別注射于不同組大鼠的左腳掌，CFA大鼠隨機(jī)分為三組，對(duì)照組，0.2或2μgIL-17抗血清組。IL-17抗血清共椎管注射三次，分別于CFA注射前24小時(shí)(阻斷IL-17的基礎(chǔ)分泌)，以及每次行為測(cè)試前2

10、小時(shí)(阻斷CFA誘導(dǎo)的IL-17分泌)，對(duì)照組在同樣的時(shí)間點(diǎn)椎管注射10μl生理鹽水。腳掌注射生理鹽水的大鼠與CFA大鼠采取同樣的處理。熱縮足閾值分別于CFA注射前48小時(shí)(基礎(chǔ)值)，以及注射后2小時(shí)、24小時(shí)檢測(cè)。行為測(cè)試完成后取大鼠脊髓腰膨大同側(cè)(CFA注射側(cè))背角，westernblot法檢測(cè)IL-17RA、p-NR1的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)五，正常大鼠隨機(jī)分為5組，分別椎管注射10μl生理鹽水，10ng、100ng、400n

11、gIL-17或400ngIL-17+2μgIL-17抗血清，熱縮足閾值分別于CFA注射前48小時(shí)(基礎(chǔ)值)，以及注射后2小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)檢測(cè)。因?yàn)镮L-17在注射第24小時(shí)時(shí)對(duì)大鼠熱縮足閾值的影響最大，另取5組同樣處理的大鼠，于IL-17椎管注射后24小時(shí)獲取脊髓腰膨大背角，westernblot法檢測(cè)IL-17RA、p-NR1的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)六，動(dòng)物隨機(jī)分為3組，模型+電針組(CFA+EA)、模型+假電針組(CFA

12、+Sham)，對(duì)照+假電針組(Saline+Sham)，每組7只。分別于CFA注射前48小時(shí)(基礎(chǔ)值)、注射后2小時(shí)和24小時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的熱縮足閾值，行為學(xué)測(cè)試完成后，免疫組化法檢測(cè)脊髓腰膨大IL-17的表達(dá)，Westernblot法監(jiān)測(cè)IL-17RA、p-NR1的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)七，動(dòng)物隨機(jī)分為3組，即生理鹽水+假電針組(Saline+Sham)、IL-17+假電針組(IL-17+Sham)、IL-17+電針組(IL-17+E

13、A)，每組8只。注射后2小時(shí)和24小時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的熱縮足閾值，行為學(xué)測(cè)試完成后，Westernblot法監(jiān)測(cè)IL-17RA、p-NR1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、紫杉醇注射后第13到第20天，施以假電針的化療痛模型大鼠對(duì)不同機(jī)械刺激的反應(yīng)率明顯高于非疼痛對(duì)照組(P<0.05).與模型+假電針組相比，10Hz電針可明顯降低模型大鼠對(duì)4、8、15g弗萊毛的反應(yīng)率(P<0.05)，但是100Hz電針僅對(duì)15g弗萊毛的反應(yīng)率

14、有影響。
　　 2、對(duì)于椎管注射生理鹽水的化療痛模型大鼠，與假電針組相比，電針可明顯降低大鼠對(duì)不同機(jī)械刺激的反應(yīng)率(P<0.05)；但是椎管注射μ阿片類受體拮抗劑(CTOP)的化療痛模型大鼠，施以電針后，與椎管注射生理鹽水的化療痛模型鼠施以假電針后對(duì)各機(jī)械刺激的反應(yīng)無(wú)明顯差異(P>0.05)；對(duì)于施以假電針的化療痛模型大鼠，椎管注射CTOP與椎管注射生理鹽水無(wú)差異(P>0.05)。椎管注射δ或κ阿片類受體拮抗劑與注射CTOP的結(jié)

15、果類似。
　　 3、免疫熒光雙標(biāo)法表明，IL-17在脊髓腰膨大與星狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP共表達(dá)。在CFA炎性痛大鼠模型，同側(cè)(CFA注射側(cè))背角Ⅰ-Ⅱ?qū)?，IL-17在CFA注射后2小時(shí)、24小時(shí)計(jì)數(shù)均高于生理鹽水組(P<0.01).對(duì)側(cè)Ⅰ-Ⅱ?qū)覫L-17陽(yáng)性細(xì)胞同樣輕度升高，但與生理鹽水組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在CFA注射后24小時(shí)，同側(cè)、對(duì)側(cè)Ⅰ-Ⅱ?qū)拥腎L-17表達(dá)亦存在明顯差異(P=0.039).在背角Ⅴ-Ⅵ層

16、，與生理鹽水組相比，CFA注射兩小時(shí)后，雙側(cè)IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯升高(P<0.05)。CFA注射24小時(shí)后，僅同側(cè)IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高(P=0.034)。在背角X層，與生理鹽水組相比，IL-17在CFA注射后兩小時(shí)明顯升高(P=0.049)，但是注射后24小時(shí)無(wú)明細(xì)差異(P=0.167)。在背角Ⅲ-Ⅳ層，各組間IL-17表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 免疫熒光雙標(biāo)法表明，IL-17RA與NR1表達(dá)在同一類脊髓神

17、經(jīng)細(xì)胞中
　　 4、IL-17抗血清可明顯抑制CFA炎性痛模型大鼠的熱痛覺過敏，此效應(yīng)呈劑量依賴，重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，藥物主效應(yīng)(p<0.05)，時(shí)間(P<0.001)，時(shí)間和藥物交互效應(yīng)(P=0.84)。組間比較顯示，與生理鹽組相比，2μgIL-17抗血清椎管注射可明顯提高炎性痛大鼠的同側(cè)熱縮足閾值(P<0.05)。IL-17對(duì)CFA注射對(duì)側(cè)腳掌無(wú)影響。
　　 Western-blot顯示，p-NR1在CFA炎性痛大

18、鼠模型脊髓背角明星升高，與非模型組(腳掌注射生理鹽水)相比。P<0.05，這種升高可被椎管注射2μgIL-17明顯抑制(P<0.05)。
　　 IL-17RA在CFA炎性痛大鼠模型脊銹背角明星升高，與非模型組(腳掌注射生理鹽水)相比，P<0.05；與椎管注射生理鹽水或0.2μgIL-17抗血清相比，2μgIL-17抗血清可使CFA炎性痛大鼠IL-17RA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　 5、IL-17椎管注射可引起大

19、鼠熱縮足閾值降低，此效應(yīng)呈劑量依賴。注射400ngIL-17，在2小時(shí)后開始起效，24小時(shí)后達(dá)到峰值，48小時(shí)后恢復(fù)正常。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示：藥物主效應(yīng)(P<0.001)，時(shí)間效應(yīng)(P<0.0001)，藥物和時(shí)間交互效應(yīng)(P<0.05)。組間比較顯示，與生理鹽水組相比，IL-17100ng和400ng在椎管注射后第2-24小時(shí)可使大鼠熱縮足閾值明顯升高(分別為P<0.01和P<0.0001)。IL-17與IL-17抗血清聯(lián)合注射則不存

20、在這種影響。
　　 與行為學(xué)測(cè)試一致，IL-17可引起NR1磷酸化的升高，此效應(yīng)呈劑量依賴。IL-17抗血清可阻斷這種效應(yīng)。
　　 同樣，IL-17可引起IL-17RA的升高，此效應(yīng)呈劑量依賴。IL-17抗血清可阻斷這種效應(yīng)。
　　 6、熱縮足閾值測(cè)試結(jié)果顯示，與假電針組相比，電針實(shí)施后2-24小時(shí)可有效抑制CFA引起的痛覺過敏。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：CFA注射同側(cè)，藥物主效應(yīng)(P<0.01)，時(shí)間效應(yīng)(P<

21、0.01)，藥物和時(shí)間交互效應(yīng)(P<0.01).組間比較顯示，與生理鹽水組相比，CFA第2-24小時(shí)可使大鼠熱縮足閾值明顯降低(P<0.01)。電針可顯著抑制這種降低(P<0.05)。CFA注射對(duì)對(duì)側(cè)腳掌的熱縮足閾值無(wú)顯著影響，各組間比較(P>0.05)
　　 與非模型組相比，假電針組炎性痛模型大鼠的IL-17，P-NR1和IL-17RA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。電針可顯著抑制這種升高(P<0.05)。
　　

22、7、熱縮足閾值測(cè)試結(jié)果顯示(雙側(cè)平均值)，與假電針組相比，電針實(shí)施后2-24小時(shí)可有效抑制IL-17椎管注射引起的痛覺過敏。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：治療主效應(yīng)(P<0.01)，時(shí)間效應(yīng)(P<0.01)，藥物和時(shí)間交互效應(yīng)(P<0.01).組間比較顯示，與生理鹽水組相比，IL-17第2-24小時(shí)可使大鼠熱縮足閾值明顯降低(P<0.01)。電針可顯著抑制這種降低(P<0.05)。
　　 與非模型組相比，椎管注射IL-17的假電針組

23、大鼠的p-NR1和IL-17RA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。電針可顯著抑制這種升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、電針可通過上述三種阿片類受體有效抑制化療引起的神經(jīng)痛；電針可做為化療相關(guān)疼痛的一種有效替代治療手段。
　　 2、脊髓星狀膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)IL-17，脊髓IL-17可通過誘導(dǎo)NR1的磷酸化引起炎性疼痛。
　　 3、電針可通過抑制脊髓IL-17的表達(dá)緩解炎性疼痛。