BH3-only蛋白BIM與吉非替尼和順鉑誘導(dǎo)的非小細胞性肺癌細胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、背景及目的：
　　 腫瘤細胞的一個基本特征是細胞增殖與細胞凋亡的不平衡，而化療藥物殺死腫瘤細胞的主要機制就是誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞毒性化學(xué)藥物治療(化療)無選擇性，在殺傷癌細胞的同時也殺傷增殖的正常細胞。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinases inhibitors，TKIs)如吉非替尼(Gefitibib，商品名為Iressa)治療可以使腫瘤縮小。然而在其臨床試驗和治療中，僅有一部分非小細胞肺癌(NSCLC)人群對藥物有反

2、應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)肺癌化療敏感性低和吉非替尼的耐藥與腫瘤細胞的凋亡耐受相關(guān)。Bcl-2家族中BH3-only蛋白在線粒體調(diào)節(jié)的“內(nèi)源性凋亡途徑”中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，被稱為“凋亡增敏蛋白”。其中，促凋亡蛋白Bim被認為在乳腺癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。因此從肺癌的凋亡耐受及死亡機制著手，研究NSCLC不同治療反應(yīng)性的機制、以從中篩選出最適治療對象進行有針對性的治療具有重要臨床意義。
　　 本研究旨在通過探索

3、化療藥物順鉑和TKIs吉非替尼體外誘導(dǎo)非小細胞性肺癌細胞凋亡的分子機制，并進一步探討B(tài)im在決定非小細胞性肺癌細胞對吉非替尼和順鉑誘導(dǎo)其凋亡的敏感性中的潛在作用，更好地了解非小細胞性肺癌細胞對抗TKIs和化療藥物抵抗的生物學(xué)基礎(chǔ)，以尋找克服腫瘤細胞對凋亡抵抗的有效途徑。
　　 第一部分、吉非替尼對肺癌細胞株的生長抑制作用
　　 目的：評價吉非替尼對四種人NSCLC細胞株.A549(EGFR野生型)、H1299(EGFR野

4、生型)、PC-9(EGFR突變型)和PC-9/BB4(亞克隆耐藥株)的生長抑制作用，以及誘導(dǎo)凋亡與Bim蛋白表達的關(guān)系。
　　 方法：選取四種非小細胞性肺癌細胞株P(guān)C-9，PC-9/BB4，A549，H1299；MTT檢測細胞株對吉非替尼的藥物敏感性和耐藥性：流式細胞儀Annexin-V/PI法檢測不同時點的細胞凋亡率：western blot檢測細胞株給藥前后Bim蛋白表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、吉非替

5、尼對四種非小細胞肺癌細胞株均有明顯生長抑制作用，并且這種抑制作用呈現(xiàn)出時間依賴性特點(P<0.05)。作用48h后，其IC50值分別為：PC9(0.03-0.05)μmol/L，PC9/BB4(5±0.25)μmol/L，A549(9±0.06)μmol/L，H1299(12.5±0.54)μmol/L(P<0.05)。
　　 2、吉非替尼誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡的變化：藥物組的細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)，且隨著藥

6、物濃度升高凋亡率相應(yīng)增高，凋亡與藥物濃度呈正相關(guān)，具有劑量依賴性。選用1μmol/L吉非替尼不同時點(0h，24h，48h，72h)處理PC-9細胞并對其細胞凋亡率進行檢測，可見吉非替尼誘導(dǎo)NSCLC細胞凋亡具有時間依賴性。1μmol/L吉非替尼作用下A549、H1299以及PC-9/BB448h凋亡率均低于5％，再次說明這三株細胞株對順鉑誘導(dǎo)的凋亡具有相對抵抗性。
　　 3、吉非替尼誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡前后Western

7、blot結(jié)果：給予吉非替尼敏感株P(guān)C-91μmol/L吉非替尼，發(fā)現(xiàn)Bim在未給藥時表達并不明顯，隨著藥物作用時間的延長，細胞株凋亡率隨之增加，BimEL、BimL的表達也隨之增強。而存耐藥株P(guān)C-9/BB4中發(fā)現(xiàn)其凋亡情況小明顯，與之相關(guān)的Bim表達亦不明顯。
　　 結(jié)論：吉非替尼誘導(dǎo)不同的NSCLC細胞株凋亡，Bim表達水平與吉非替尼誘導(dǎo)NSCLC敏感株P(guān)C-9細胞凋亡呈正相關(guān)，即隨著Bim蛋白表達水平的下調(diào)，吉非替尼誘導(dǎo)P

8、C-9細胞的凋亡率也明顯降低。內(nèi)在凋亡途徑有可能通過Bim影響了肺癌細胞株對于吉非替尼的反應(yīng)性。特異性“沉默”Bim的轉(zhuǎn)錄，可以使吉非替尼誘導(dǎo)的敏感PC-9細胞株凋亡減少，從而實際上避免了吉非替尼在該細胞株誘導(dǎo)的凋亡。相比之下，對照siRNA的細胞在吉非替尼作用下繼續(xù)進行細胞凋亡反應(yīng)。在每三個獨立的實驗中，吉非替尼在PC-9細胞誘導(dǎo)的細胞凋亡百分比明顯有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，從而證實Bim是吉非替尼誘導(dǎo)細胞凋亡的必須因子。

9、>　　 第二部分、BimSiRNA對吉非替尼誘導(dǎo)肺細胞株凋亡的影響
　　 目的：評價Bim siRNA對吉非替尼誘導(dǎo)吉非替尼敏感株(EGFR突變型)和吉非替尼獲得性耐藥株凋亡的影響。
　　 方法：應(yīng)用RNAi技術(shù)，以化學(xué)合成的Bim siRNA(小干擾RNA)體外轉(zhuǎn)染，流式細胞術(shù)、western blot檢測轉(zhuǎn)染前后肺癌細胞凋亡、Bim蛋白、Bcl-2,pAKT等指標的變化及關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　

10、1、隨著siRNA特異性“沉默”Bim基因抑制Bim蛋白的表達，吉非替尼誘導(dǎo)PC-9細胞的凋亡率也明顯降低。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩者存在相關(guān)性(P<0.05)。相比之下，對照siRNA的細胞在吉非替尼作用下繼續(xù)進行細胞凋亡反應(yīng)。
　　 2、轉(zhuǎn)染后，吉非替尼誘導(dǎo)后PC-9/BB4細胞的Bim蛋白表達水平明顯降低而NSCLC細胞的凋亡率有少量降低。
　　 3、特異性siRNA“沉默”Bim基因前后以及吉非替尼誘導(dǎo)PC-9細胞凋亡前

11、后的Bcl-2蛋白表達水平和pAKT的蛋白水平也無明顯差異。
　　 結(jié)論：Bim是吉非替尼誘導(dǎo)敏感株細胞凋亡的必須因子。PI3K/AKT途徑和Bcl-2可能與TKI對于肺癌的耐藥無關(guān)。
　　 本研究在一定程度上證實了Bim在吉非替尼誘導(dǎo)的NSCLC細胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，同時提示我們是否可以將Bim作為臨床治療NSCLC的分子靶點或聯(lián)合其他藥物進行特異性靶向治療，為NSCLC的治療開辟新的思路。
　　 第三部分

12、、Bim在順鉑誘導(dǎo)肺癌細胞株死亡中的作用
　　 目的：探討B(tài)im表達在順鉑誘導(dǎo)肺癌細胞株死亡中的作用。
　　 方法：采用不同濃度的順鉑不同時間處理體外培養(yǎng)上述四種非小細胞性肺癌細胞株。MTT檢測細胞株對順鉑的藥物反應(yīng)性：流式細胞儀Annexin-V/PI法檢測不同時點的細胞凋亡率：western blot檢測細胞株給藥前后Bim蛋白表達變化；在PC-9和PC-9/BB4中采用siRNA技術(shù)特異性“沉默”，Bim基因；We

13、stern blot分別檢測“沉默”Bim基因前后順鉑誘導(dǎo)細胞株中的Bim蛋白的表達水平變化。Annexin V-PI染色流式細胞儀檢測順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡水平。
　　 結(jié)果：順鉑誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞死亡具有時間和劑量依賴性，作用48h后，其IC50值分別為：PC9(8±0.02)μg/ml，PC9/BB4(5±0.12)μg/ml，A549(6±0.23)μg/ml，H1299(8±0.26)μg/ml。劑量8μg/ml的順鉑處

14、理相同時間(48h)后的A549、H1299、PC-9和PC-9/BB4凋亡率(包括早期和晚期)分別為58.7％、47.8％、45.3％、59.3％。BH3-only蛋白Bim的表達上調(diào)和移位活化參與了順鉑誘導(dǎo)的非小細胞性肺癌細胞凋亡。以8μg/mL順鉑分別處理PC-9以及PC-9/BB4后對Bim蛋白的表達水平進行檢測，Bim蛋白的表達較陰性對照組均有明顯增強，組間差異無顯著意義(P>0.05)。特異性siRNA“沉默”Bim基因后，

15、順鉑誘導(dǎo)后PC-9和PC-9/BB4細胞株的Bim蛋白表達水平明顯降低。隨著siRNA特異性“沉默”Bim基因抑制Bim蛋白的表達，順鉑誘導(dǎo)PC-9細胞的凋亡率有少量降低，但是PC-9/BB4細胞株中凋亡率沒有明顯降低。因此沉默Bim表達并不能顯著降低順鉑誘導(dǎo)細胞的凋亡率，考慮與順鉑除誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡外還誘導(dǎo)其它形式的細胞死亡有關(guān)。
　　 結(jié)論：Bim在順鉑誘導(dǎo)的非小細胞肺癌細胞凋亡中起到一定作用，是決定非小細胞性肺癌細