基于尿液mRNA檢測的糖尿病腎病生物標(biāo)志物研究.pdf

1、目的:糖尿病腎?。╠iabeticnephropathy，DN）是糖尿病最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，最終將進(jìn)展為終末期腎臟?。╡ndstagerenaldisease，ESRD）。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要病理變化包括腎臟肥大、腎小球基底膜（glomerularbasementmembrane，GBM）增厚及腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）積聚，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。足細(xì)胞是附著

2、于腎小球基底膜上的上皮細(xì)胞，足細(xì)胞肥大、數(shù)量減少、足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)改變均是DN發(fā)病及進(jìn)展的重要原因。上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialtomesenchymaltransition，EMT)是促進(jìn)ECM積聚的重要機(jī)制。在DN復(fù)雜病理環(huán)境下，足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞都將經(jīng)歷EMT過程而失去其正常生物學(xué)功能。此外，腎小管損傷也是DN的重要發(fā)病機(jī)制之一。近年來，隨著穩(wěn)定的RNA抽提技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-tim

3、efluorescencePCR)技術(shù)的發(fā)展成熟，檢測尿液沉渣細(xì)胞mRNA(messengerRNA)的水平可能成為探索DN新的生物標(biāo)志物的無創(chuàng)技術(shù)平臺(tái)。因此，本研究的目的在于:1、構(gòu)建基于SYBRgreen(I)的real-timePCR檢測尿液沉渣細(xì)胞mRNA水平的技術(shù)，評估其靈敏度、特異性及穩(wěn)定性;利用所構(gòu)建的方法檢測DN患者尿液足細(xì)胞相關(guān)mRNA、腎小管損傷相關(guān)mRNA以及EMT相關(guān)mRNA水平的改變;2、構(gòu)建能夠同時(shí)檢測尿液多

4、種mRNA水平的PCR芯片，并初步探討其在DN患者尿液mRNA檢測中的價(jià)值。
　　 方法:本研究以臨床2型DN患者及健康對照者作為研究對象，2型DN診斷參照2007年NKFKDOQI指南。根據(jù)DN患者腎小球率過濾(estimatedglomerularfiltrationrate,eGFR)或尿白蛋白排泄率(urinaryalbuminexcretion，UAE)將DN患者分為不同進(jìn)展組。收集研究對象尿液細(xì)胞，提取總RNA并進(jìn)行

5、逆轉(zhuǎn)錄，利用real-timePCR技術(shù)檢測上述研究對象尿液足細(xì)胞相關(guān)mRNA、腎小管損傷相關(guān)mRNA以及EMT相關(guān)mRNA水平并評估其與臨床指標(biāo)間的相關(guān)性。同時(shí)，選取DN發(fā)生及進(jìn)展過程中88種相關(guān)分子作為目的mRNA設(shè)計(jì)特異性引物并構(gòu)建mRNA芯片，初步探討利用PCR芯片檢測尿液mRNA的可行性及臨床意義。
　　 結(jié)果:以podocalyxin及CD2-AP作為目的基因構(gòu)建的real-timePCR檢測尿液沉渣細(xì)胞mRNA水平

6、的方法特異性高;最低檢測濃度對應(yīng)Ct值分別為35、33.2286;所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.9958、0.9992，相對高濃度及低濃度樣品組間及組內(nèi)變異均小于3％。DN患者尿液足細(xì)胞相關(guān)mRNA(synaptopodin、podocalyxin、CD2-AP、α-actinin4以及podocin)、腎小管損傷相關(guān)mRNA(KIM-1)以及EMT相關(guān)mRNA(α-SMA、fibronectin以及MMP-9)較正常組顯著升高，且

7、可有效區(qū)分DN及健康對照組。同時(shí)，上述目的mRNA尿液水平隨DN進(jìn)展呈現(xiàn)增高趨勢，并與臨床指標(biāo)(尿微量白蛋白、尿素氮、肌酐、eGFR)相關(guān)。此外，本研究所構(gòu)建的PCR芯片可準(zhǔn)確定量88種目的mRNA。與健康對照組相比，DN患者29種mRNA水平顯著升高(p＜0.05)。其中α-actinin4、CDH2、ACE、FAT1、synaptopodin、COL4α、twist及NOTCH3mRNA水平較健康對照組升高15倍以上。而DN患者尿液

8、TIMP-1mRNA水平顯著降低(p＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究構(gòu)建了一種新穎的SYBRGREEN(I)real-timePCR檢測尿液沉渣細(xì)胞mRNA的方法。該方法標(biāo)準(zhǔn)品制備快速簡便，靈敏度、特異度高，穩(wěn)定性及重復(fù)性好。所構(gòu)建的方法為無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測尿液疾病相關(guān)mRNA提供了新的技術(shù)平臺(tái)。
　　 2、DN患者尿液足細(xì)胞相關(guān)mRNA(synaptopodin、podocalyxin、CD2-AP、