基于尿液mRNA芯片檢測的腎臟纖維化生物標志物研究.pdf

1、目的:腎臟纖維化(renal fibrosis，RF)是所有慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進展的共同病理表現(xiàn)。腎臟纖維化發(fā)病機制復(fù)雜，其中局部炎癥反應(yīng)的形成、炎癥介質(zhì)釋放、腎臟固有細胞（包括系膜細胞、足細胞、內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞等）活化和凋亡（或壞死）、胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)堆積是導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)毀損的共同關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前腎臟纖維化診斷主要依賴腎穿刺活檢這一有創(chuàng)性檢

2、查手段，臨床上尚缺乏無創(chuàng)性檢查方法。近年來，尿沉渣細胞及其分子生物學信息檢測技術(shù)日益成熟，可能為探索腎臟纖維化相關(guān)生物標志物提供嶄新的無創(chuàng)技術(shù)平臺。因此，本研究目的在于:基于尿液mRNA檢測技術(shù)，構(gòu)建可同時檢測多種尿液mRNA水平的腎臟纖維化靶向熒光定量PCR(polymerasechain reaction)芯片，發(fā)現(xiàn)和驗證CKD患者腎臟纖維化相關(guān)生物標志物，并對IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)患者腎臟纖維化進

3、行聯(lián)合生物標志物研究。
　　方法:
　　1.基于尿沉渣細胞mRNA檢測技術(shù)，選出86種腎臟纖維化可能相關(guān)基因并構(gòu)建靶向表達譜PCR芯片。選取50例經(jīng)腎臟活檢證實的CKD患者，利用所構(gòu)建的real-time PCR芯片進行尿沉渣mRNA檢測評估，分析芯片的靈敏度、特異度和可重復(fù)性分析。
　　2.選取在東南大學附屬中大醫(yī)院住院治療的135例經(jīng)腎臟活檢證實的CKD患者和31例健康對照(healthy control，HC)，

4、分為篩查組和驗證組。使用所構(gòu)建的腎臟纖維化靶向熒光定量PCR芯片檢測尿沉渣細胞mRNA表達水平，分析目標基因在CKD患者和健康對照之間的表達差異，并與血肌酐（serumcreatinine，Scr），尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，腎小球濾過率(estimateglomerular filtration rate，eGFR)，腎小球硬化(glomerular sclerosis, GS)積分和小管間質(zhì)纖維化(t

5、ubular interstitial fibrosis，TIF)積分進行相關(guān)性分析，篩選出腎臟纖維化的生物標志物并在另一組CKD患者中進行驗證，評價芯片所篩選的基因?qū)δI臟纖維化的診斷價值。
　　3.選取在東南大學附屬中大醫(yī)院住院治療的74例經(jīng)腎臟活檢證實的IgA腎病患者和31例健康對照。構(gòu)建由90個IgA腎病發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因組成的IgA腎病靶向表達譜PCR芯片并通過芯片檢測IgA腎病患者和健康對照的尿液mRNA，發(fā)現(xiàn)差異表達基因

6、，并與腎功能指標、牛津分級(Oxford classification)、纖維化評分等相關(guān)性分析，篩選出IgA腎病腎臟纖維化相關(guān)候選基因標志物。利用線性判別分析（Fisher's linear discriminant analysis）對候選基因構(gòu)建聯(lián)合生物標志物，通過自身驗證和交互驗證評估聯(lián)合標志物在IgA腎病患者中腎臟纖維化的診斷價值。
　　結(jié)果:
　　1.本研究構(gòu)建的腎臟纖維化靶向PCR芯片可準確定量檢測86種目的m

7、RNA。該芯片基因擴增曲線圖譜呈S型，熔解曲線分析呈單峰;所有樣本基因檢測陽性率均大于85％; PPC孔均值20.63±0.35，變異度僅為1.69％。
　　2.通過芯片檢測發(fā)現(xiàn)篩查組和驗證組中CKD患者尿液VIM mRNA水平較健康對照組顯著升高。Spearman相關(guān)性分析提示，VIM mRNA水平與血肌酐、尿素氮、腎小球濾過率、腎小球硬化評分和小管間質(zhì)纖維化評分之間存在顯著相關(guān)。Multiple logistic regres

8、sion進一步提示，尿液VIM mRNA表達水平是腎臟纖維化的重要危險因素并可有效區(qū)分不同嚴重程度的纖維化。
　　3.IgA腎病腎臟纖維化相關(guān)PCR芯片90個候選基因中，有50個尿液mRNA在IgA腎病和健康對照中存在顯著表達差異，其中BCL2、CASP3、PAI1、TIMP2、VIM，P53、SYNPO、MCP-1、TGF-β1的mRNA水平與血清肌酐、eGFR和腎臟纖維化評分顯著相關(guān)。利用BCL2、PAI1、TGF-β1三個基

9、因構(gòu)建的聯(lián)合標志物可有效診斷IgA腎病患者腎臟纖維化水平，其中敏感性、特異性、約登指數(shù)分別為91.3％，85.7％，0.77，ROC分析提示曲線下面積為0.92(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究首次構(gòu)建了一種腎臟纖維化靶向的熒光定量PCR芯片。所構(gòu)建的纖維化靶向PCR芯片具有良好的靈敏度、特異度和可重復(fù)性，為腎臟纖維化無創(chuàng)性診斷提供了新的技術(shù)平臺。
　　2.尿液VIM mRNA水平可有效區(qū)分不同嚴重程度的纖