豬流行性腹瀉病毒nsp7抑制Ⅰ型IFN信號轉導機制研究.pdf

1、由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬腹瀉給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，該病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，大小約28kb，共編碼16個非結構蛋白(nsp1～nsp16)，4個結構蛋白（S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白）及一個輔助蛋白ORF3。
　　在病毒的感染過程中，宿主細胞能夠產生多種抵抗病毒入侵的分子，包括干擾素（Inte

2、rferon，IFN），促炎性細胞因子以及趨化因子等。干擾素及其誘導的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)是宿主抗病毒感染的重要防御機制，但病毒往往進化出各種策略拮抗宿主干擾素的抗病毒作用，從而達到感染宿主并致病的目的。已有研究證實PEDV具有抑制Ⅰ型IFN產生和信號轉導的能力，但對其編碼的nsp7蛋白在其中的作用尚不清楚。鑒于此，本論文以PEDV nsp7為研究對象，開展了以下研究:
　　1.PE

3、DV nsp7抑制ISRE啟動子活化和ISGs的產生
　　PEDV可以感染不同年齡段的豬，因此其免疫逃逸策略的研究十分值得我們關注。而許多病毒拮抗IFN的免疫應答多是憑借其編碼產生的蛋白實現的。因此，本研究篩選了參與抑制ISRE啟動子活化的PEDV編碼蛋白，結果顯示，nsp7能夠顯著抑制IFN-α介導的ISRE啟動子活化，且其抑制效果呈明顯的劑量依賴性。同時，熒光定量PCR實驗證實PEDV nsp7能夠顯著抑制ISG15、ISG5

4、4及ISG56在mRNA水平上的表達。
　　2.PEDV nsp7不影響JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2磷酸化和ISGF3的形成
　　許多病毒在進化過程中形成多種策略來擾亂Ⅰ型IFN的信號轉導。Western blot實驗顯示，PEDV nsp7不影響JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2的蛋白表達以及磷酸化水平，同時對STAT1/STAT2/IRF9三者組成的復合物ISGF3的形成也沒有影響，但是可以顯著抑制

5、ISGF3復合物誘導的ISRE啟動子活化，并且與ISGF3間存在相互作用。ISGF3的入核是ISGs產生的必須環(huán)節(jié)。PEDV nsp7不影響STAT1、STAT2的表達與磷酸化及ISGF3復合物的形成，但卻抑制ISGF3誘導的ISRE啟動子活性，那么它是否會影響STAT1、STAT2的入核呢？我們分別進行間接免疫熒光實驗和胞質胞核分離實驗進行檢測，結果顯示，PEDV nsp7能夠顯著抑制STAT1、STAT2、IRF9的核轉運。

6、　　3.PEDV nsp7與KPNA1競爭性結合STAT1，阻礙ISGF3核轉運
　　由于PEDV nsp7明顯地抑制STAT1、STAT2、IRF9的入核，且PEDV nsp7與ISGF3復合物存在相互作用，推測PEDV nsp7的抑制效果可能是通過與STAT1、STAT2或IRF9相互作用實現的。通過免疫共沉淀實驗我們得出結論，PEDV nsp7與IRF9間不存在相互作用，但可與STAT1、STAT2發(fā)生互作，且特異性結合ST

7、AT2的DBD結構域，此結構域在STATs蛋白家族中同源性較高，存在非典型的NLS序列，是ISGF3復合物被核轉運蛋白KPNA1識別的關鍵氨基酸序列。鑒于此，我們利用CO-IP實驗檢測nsp7是否影響KPNA1與STAT1的結合。結果表明，隨著nsp7轉染量的增加，KPNA1與STAT1間的互作逐步減弱，因此，PEDV nsp7通過與KPNA1競爭性結合STAT1，抑制KPNA1對STAT1的識別，從而特異性阻礙了ISGF3核轉運。

8、r>　　4.PEDV nsp7負調控Ⅰ型IFN信號轉導與nsp8無關
　　已有研究表明，貓冠狀病毒nsp7/nsp8復合物晶體結構呈現2∶1的異源三聚體形式，與nsp7的結合可增強nsp8的RNA聚合酶活性;SARS冠狀病毒中nsp7/nsp8以8∶8的形式組成十六聚體，能夠顯著增強nsp8具有的RdRp活性且具有引物延伸能力。那么，nsp7對JAK-STAT信號通路的抑制作用是否與nsp8相關呢？我們將nsp7、nsp8單獨轉染