AT-Ⅲ基因突變及多態(tài)性與孕產(chǎn)婦靜脈血栓栓塞相關(guān)性研究.pdf

1、背景與目的： 靜脈血栓栓塞(Venousthromboembolism，VTE)是由多種致病機(jī)理導(dǎo)致的一種血管性疾病，臨床表現(xiàn)分為深靜脈血栓栓塞(deepvenousthrombosis，DVT)和肺栓塞(pulmonaryembo-lism,PE)。孕產(chǎn)婦因病理生理性改變，使VTE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。DVT盡管不常見，但其并發(fā)癥：因栓子脫落形成PE易導(dǎo)致猝死，及血栓后綜合征嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。PE是妊娠期及產(chǎn)褥期孕產(chǎn)婦死亡的一大

2、重要原因，約占?xì)W洲孕產(chǎn)婦死率的50％。隨著尸解率的升高，其實(shí)際發(fā)病率進(jìn)一步升高。DVT若不及時(shí)處理，有24％發(fā)生PE，其中約有13％的孕產(chǎn)婦死亡；若給予適當(dāng)?shù)目鼓委煟琍E發(fā)生率可降低至15％，孕產(chǎn)婦死亡率可降低至1％以下。故其早期診斷，早期預(yù)防日益受到重視。 VTE是一種多基因遺傳病，而國際公認(rèn)的VTE遺傳性危險(xiǎn)因子FVL、FIIG20210A等位基因突變不足成為中國人群VTE的危險(xiǎn)因素?？鼓?III(antithromb

3、in,AT-III)基因是最早發(fā)現(xiàn)的VTE遺傳性危險(xiǎn)因素。AT-IIl基因SERPINC1(基因庫X68793.1，MIM＃107300)位于1q23～25，全長13.9kb，有7個(gè)外顯子(外顯子1、2、3A、3B、4、5和6)和6個(gè)內(nèi)含子。AT-III編碼一種由432個(gè)氨基酸組成的單鏈糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為58.2ku，該蛋白是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一。遺傳性AT缺陷癥是遺傳性VTE的危險(xiǎn)因素之一，是一種常染色體顯性遺傳病。A

4、T-III缺乏在正常人群中約占0.02％～0.17％，在家族性VTE患者中約占4％～7％。AT-III是機(jī)體內(nèi)最重要的抗凝血物質(zhì)，主要抑制凝血酶的活性，占血漿中全部抗凝活性的70％～80％，在肝素的作用下抗凝活性增強(qiáng)1000～3500倍。AT通過Arg393～ser394的絲氨酸蛋白酶反應(yīng)點(diǎn)及Lys殘基和Arg殘基二個(gè)功能位點(diǎn)，與肝素、凝血酶結(jié)合，發(fā)揮其抗凝作用。其它功能主要有：調(diào)節(jié)蛋白C(PC)受體活性：抑制白細(xì)胞活化等抗炎活性；抗腫

5、瘤和抗血管新生作用：抑制中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞核因子κB(NF-κB)介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附，改善微循環(huán)等。AT-III基因突變除了與VTE相關(guān)外，還與心肌梗死、癲癇、老年癡呆等疾病相關(guān)。目前已報(bào)道的AT-III基因突變約180余種，其中，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的AT缺陷類型主要有5種，分別為Exon2上2757C>T，2759C>T，Exon5上9850A>G，Exon6上13328G>A等雜合突變，13389delG引起移

6、碼突變。 篩查AT-III基因多態(tài)性的常用方法有：限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性法，單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析法，等位基因特異的寡核苷酸印記法，毛細(xì)管電泳檢測(cè)法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法，直接測(cè)序等。DHPLC是近幾年發(fā)展起來的一種高通量突變篩查方法，由于其檢測(cè)效率高、快速、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，在許多遺傳性疾病和腫瘤研究中得到了廣泛的應(yīng)用。而目前國內(nèi)、外運(yùn)用DHPLC篩查孕產(chǎn)婦VTE患者AT-III基因多態(tài)性方面研究未見報(bào)道。 本研究的目的

7、是：根據(jù)DHPLC技術(shù)平臺(tái)對(duì)孕產(chǎn)婦人群VTE患者AT-III基因多態(tài)性進(jìn)行快速準(zhǔn)確的篩查，以發(fā)現(xiàn)國內(nèi)孕產(chǎn)婦VTE患者中AT-III基因突變及常見多態(tài)性位點(diǎn)；探索AT-III基因突變及多態(tài)性與孕產(chǎn)婦VTE的相關(guān)性；為孕產(chǎn)婦VTE患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。 設(shè)計(jì)與方法： 1.臨床表型檢測(cè)，AT-III抗原水平(AT-III：Ag)、AT-III血漿活性水平(AT-II:A)檢測(cè)：AT-III：Ag測(cè)定采用ELISA

8、法，AT-III：A檢測(cè)采用發(fā)色底物法。 2.針對(duì)AT-III的啟動(dòng)子區(qū)，7個(gè)外顯子及其包括剪接位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物及優(yōu)化Touch-DownPCR擴(kuò)增條件。通過DNA測(cè)序獲得AT-III的各擴(kuò)增片段野生純合型基因型標(biāo)準(zhǔn)品. 3.建立檢測(cè)AT-III基因的PCR-DHPLC技術(shù)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)過測(cè)序證實(shí)的野生純合型標(biāo)準(zhǔn)品1:1混合，高溫變性后緩慢復(fù)性，優(yōu)化DHPLC分析的條件，運(yùn)用DHPLC對(duì)樣品PCR產(chǎn)

9、物在半變性條件下進(jìn)行分析，通過洗脫峰保留時(shí)間峰型和位置的差異區(qū)分不同的基因多態(tài)性。 4.選取各種不同峰型的代表性標(biāo)本以及正常對(duì)照標(biāo)本2例，經(jīng)PCR擴(kuò)增相應(yīng)片斷后進(jìn)行雙向測(cè)序分析。應(yīng)用DNAstar等軟件將測(cè)序結(jié)果拼接，將待測(cè)樣本序列與基因庫中AT-III的參考序列進(jìn)行比對(duì)，以發(fā)現(xiàn)AT-III基因突變及多態(tài)性。 5.應(yīng)用SPSS11.0軟件，臨床表型生化檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行One-wayANOVA分析。根據(jù)DHPLC的分析結(jié)果，從

10、各擴(kuò)增片段中選取一定數(shù)量的代表性樣品進(jìn)行測(cè)序分析，以證實(shí)該方法的準(zhǔn)確性；運(yùn)用RxC表資料的x2檢驗(yàn)對(duì)各組間基因變異頻率的差異進(jìn)行分析；同時(shí)取病例組和對(duì)照組AT-III基因多態(tài)性無差異的4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，并應(yīng)用x2檢驗(yàn)確定該群體樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡。 結(jié)果與討論： 1.通過回顧性研究，我們采用ELISA法及發(fā)色底物法分別測(cè)定40例孕產(chǎn)婦VTE患者，50例非孕產(chǎn)婦VTE患者及80例

11、正常孕產(chǎn)婦的AT-III抗原和AT-III活性，結(jié)果提示：三組AT-III抗原含量水平均稍低于正常水平，不同組間AT-III抗原含量水平相當(dāng)(F=0.754，P=0.472)。三組間AT-III活性水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=138.119，P<0.001)。孕產(chǎn)婦VTE組及非孕產(chǎn)婦VTE組，與正常孕產(chǎn)婦組間比較，AT-III活性明顯降低(P<0.001)，而孕產(chǎn)婦VTE組及非孕產(chǎn)婦VTE組間AT-III活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0

12、.059)。VTE患者因?yàn)槟?抗凝血酶(TAT)復(fù)合物大量形成，AT-III消耗過多，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的廣泛損傷使AT-III合成障礙，造成AT-III活性顯著降低，同時(shí)極少部分患者因先天性AT-III缺陷癥致AT-III的活性下降。 2.運(yùn)用DHPLC篩查三組AT-III基因型，所有AT-III基因多態(tài)性均容易被鑒定，而且未見假陽性峰.在三組170例樣本中，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)3個(gè)(2個(gè)為已報(bào)道的致病突變，1個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的同義突變)

13、；SNP位點(diǎn)7個(gè)，其中4個(gè)為SNP庫已報(bào)道的SNP位點(diǎn)，3個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)(2個(gè)位于內(nèi)含子Intron3A+11G>A，Intron3A+50G>A，1個(gè)位于啟動(dòng)子區(qū)-115,G>A)。2種致病突變分別為Exon6G13328A的雜合突變和Intronl5’端+5位點(diǎn)G>A突變。分別因AT蛋白分泌障礙和細(xì)胞內(nèi)降解及產(chǎn)生異常不穩(wěn)定的mRNA，致AT-III抗凝活性降低，而引起相應(yīng)的臨床表型。僅發(fā)生于兩VTE組的2個(gè)SNP位點(diǎn)(Int

14、ron3A+11G>A，Intron3A+50G>A，)及1個(gè)同義突變(Exon4+243G>Ac335GTG→GTA(Val))，及有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的SNP位點(diǎn)Intron4,-53G>A，有可能影響了AT-III基因mRNA表達(dá)水平，從而導(dǎo)致VTE的發(fā)生。我們檢測(cè)的血栓組中大多數(shù)(約70％)沒發(fā)現(xiàn)有意義的突變或SNP位點(diǎn)，這些患者的臨床表型也可能因表觀遺傳學(xué)(epigenetics)修飾如：DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控等有關(guān)，或者是其

15、它相關(guān)基因的缺陷或環(huán)境因素所致。 3.x2檢驗(yàn)結(jié)果顯示該所選病例符合Hardy-Weinberg平衡，具有廣州地區(qū)中國孕產(chǎn)婦人群的代表性。 4.DHPLC具有快速，準(zhǔn)確，低成本，自動(dòng)化的特點(diǎn)，為AT-III基因相關(guān)疾病的遺傳學(xué)咨詢、流行病學(xué)調(diào)查、研究AT-III基因相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供了一種檢測(cè)方法。 5.AT-III基因突變及多態(tài)性對(duì)孕產(chǎn)婦VTE的發(fā)病存在相關(guān)性，2個(gè)致病突變之一及1例同義突變發(fā)生于孕產(chǎn)婦VT

16、E組。三種有意義的SNP位點(diǎn)在孕產(chǎn)婦VTE組中總的發(fā)生率為27.5％，遠(yuǎn)大于正常孕產(chǎn)婦的2.5％。對(duì)于孕產(chǎn)婦進(jìn)行AT-III易感基因的篩查，及早發(fā)現(xiàn)高危孕產(chǎn)婦人群，對(duì)其進(jìn)行早期預(yù)防，早期用藥，可有效地降低孕產(chǎn)婦VTE的發(fā)病率、死亡率及圍生兒死亡率。 結(jié)論： 孕產(chǎn)婦血栓組，非孕產(chǎn)婦血栓組AT-III活性較正常孕產(chǎn)婦組明顯降低，而兩血栓組間無明顯差異。AT-III基因突變是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦VTE的遺傳因素之一，功能性SNP位點(diǎn)也可