聯(lián)合抑制IGF-1R和NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的人肺癌細胞株H1650耐藥的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 靶向 IGF-1R的siRNA逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的人非小細胞肺癌細胞株H1975和H1650耐藥的研究
　　目的:研究IGF-1R特異性的siRNA對逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的人非小細胞肺癌細胞H1975和H1650耐藥的作用,并探討其可能存在的機制。
　　方法:不同濃度的吉非替尼分別處理吉非替尼耐藥的肺癌細胞株(H1975和H1650),吉非替尼敏感的肺癌細胞株(HCC827),

2、以及RNAi的表達載體分別轉(zhuǎn)染后的H1975和H1650細胞,采用MTT法檢測吉非替尼對各處理組細胞的生長抑制作用;AnnexinV-FITC和PI雙標法標記細胞后,在流式細胞儀上檢測吉非替尼濃度為0、0.01、0.1和1uM的條件下,處理24h和48h后各組細胞的凋亡水平;Western blot法檢測細胞內(nèi)EGFR、IGF-1R通路相關蛋白和凋亡相關蛋白的表達。
　　結果:HCC827、H1975和H1650細胞株的IC50值

3、分別為0.006±0.0003uM、24.62±0.3uM和18.39±0.2uM。經(jīng)1uM吉非替尼處理48h后,H1975和H1650細胞中均檢出了p-IGF-1R的高表達,而HCC827細胞中則未見明顯的p-IGF-1R。當用siRNA技術分別沉默H1975和H1650細胞中的IGF-1R后,吉非替尼在兩種細胞中的IC50值分別下降至7.94±0.1uM和9.42±0.4uM,明顯低于IGF-1R未沉默的相應細胞(P<0.05)。作

4、用24h和48h時,吉非替尼在IGF-1R沉默后的H1975和H1650細胞中誘導的凋亡比例均明顯高于IGF-1R未沉默的相應細胞株(P<0.05)。IGF-1R siRNA聯(lián)合吉非替尼作用時明顯抑制了H1975和H1650細胞中的p-IGF-1R和p-Akt的表達。
　　結論:IGF-1R siRNA能有效增強吉非替尼在耐藥的人肺癌細胞株H1975和H1650中誘導的生長抑制和凋亡效應。IGF-1R siRNA技術或可成為逆轉(zhuǎn)E

5、GFR-TKIs耐藥的新策略。
　　第二部分 聯(lián)合抑制IGF-1R和NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的人肺癌細胞株 H1650耐藥的研究
　　目的:在第一部分研究中證明,IGF-1R siRNA能夠在EGFR-TKIs耐藥的肺癌細胞中提高吉非替尼誘導的生長抑制和凋亡水平。然而,臨床試驗顯示,聯(lián)合使用IGF-1R抑制劑和EGFR-TKIs并未能在肺癌治療中取得顯效。新近發(fā)現(xiàn),NF-κB通路是影響肺癌細胞對EGFR-TKIs敏

6、感性的因素。旨在探索聯(lián)合抑制IGF-1R和NF-κB通路能否提高耐藥細胞對吉非替尼的敏感性,并探討其可能的機制。
　　方法:分別用吉非替尼和NF-κB特異性抑制劑PDTC處理IGF-1R未沉默和沉默的細胞H1650-sictrl和H1650-siIGF-1R。用MTT實驗檢測PDTC和吉非替尼對各組細胞的生長抑制作用,流式細胞術檢測細胞的凋亡水平,EMSA實驗檢測細胞內(nèi)NF-κB的DNA結合能力,Western blot法檢測細胞

7、內(nèi)EGFR、IGF-1R和NF-κB信號通路的相關蛋白表達,并檢測凋亡相關蛋白PARPcl的水平。
　　結果:IκB在吉非替尼敏感的肺癌細胞HCC827中的水平高于吉非替尼耐藥的H1975和H1650細胞,其表達因吉非替尼的作用而上調(diào)。在IGF-1R未沉默的H1650-sictrl細胞中,IκB的表達水平低于其在H1650-siIGF-1R細胞中的表達,且兩種細胞中IκB水平均隨吉非替尼濃度增加而出現(xiàn)上調(diào)。與H1650-sictr

8、l細胞相比, PDTC在H1650-siIGF-1R細胞中明顯增強了吉非替尼誘導的生長抑制和凋亡效應(P<0.05)。IGF-1R的沉默降低了NF-κB p65在H1650-siIGF-1R細胞核中的累積, NF-κB的DNA結合能力隨著IGF-1R和EGFR同時受到抑制而減弱,但仍然具有活性。PDTC對EGFR、IGF-1R、Akt、ERK、p-EGFR、p-IGF-1R、p-Akt和p-ERK等蛋白的表達均無明顯影響。
　　結