SB203580通過(guò)阻斷P38-CYLD通路抑制OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死樣凋亡.pdf

1、目的：探討p38mapkinase蛋白酶抑制劑(SB203580)在缺糖缺氧誘導(dǎo)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元壞死樣凋亡(necroptosis)中的保護(hù)機(jī)制，并深入研究其是否與CYLD有關(guān)。
　　方法：SD大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)6天后，用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β-3Tubulin及DAPI染核觀察神經(jīng)元培養(yǎng)純度;原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)14天，通過(guò)成熟神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN鑒定神經(jīng)元，DAPI核染，同時(shí)用免疫熒光共定位觀察目的蛋白CYLD在

2、神經(jīng)元內(nèi)的定位;隨后神經(jīng)元經(jīng)過(guò)ZVAD-fmk預(yù)處理30min，缺糖缺氧2小時(shí)，復(fù)灌不同時(shí)間觀察CYLD蛋白量變化并選擇表達(dá)量高峰時(shí)間點(diǎn)(0，2，6，8，12)為復(fù)灌時(shí)間;隨后神經(jīng)元被分為正常對(duì)照（Control組）、OGD組，缺糖缺氧2h，復(fù)灌8h，Western blot觀察細(xì)胞漿、核內(nèi)CYLD蛋白表達(dá)變化情況。然后實(shí)驗(yàn)組分為正常組、OGD組、OGD/DMSO組，OGD/ZVAD以及OGD/ZVAD/SB203580組，通過(guò)west

3、ern blot、免疫熒光，比色法檢測(cè)CYLD蛋白、SRF、P38蛋白及其磷酸化水平，LDH測(cè)定細(xì)胞受損程度。
　　結(jié)果：通過(guò)免疫熒光觀察神經(jīng)元特異性標(biāo) 志物β-3Tubulin及DAPI染核顯示神經(jīng)元培養(yǎng)純度在70％左右;在皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)通過(guò)NeuN和CYLD雙染顯示目的蛋白CYLD表達(dá)于胞漿、胞核，且胞核內(nèi)強(qiáng)表達(dá)，胞漿內(nèi)弱表達(dá);隨著缺糖缺氧后復(fù)灌時(shí)間的延長(zhǎng)，CYLD蛋白表達(dá)量逐漸增加，8小時(shí)達(dá)到最高水平(P＜0.05)，與LDH

4、檢測(cè)的細(xì)胞受損程度相對(duì)應(yīng)(P＜0.05);神經(jīng)元在缺糖缺氧2h，復(fù)灌8h后，Control組和OGD組胞漿CYLD蛋白水平上調(diào)(P＜0.05)，兩組胞核內(nèi)CYLD蛋白水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)，且與后續(xù)免疫熒光結(jié)果一致;加入SB203580(0.5umol/l，1h)后，CYLD蛋白水平其他各組較Control組增高(P＜0.05)，OGD/ZVAD組較OGD組、OGD/DMSO組增高(P＜0.05)，并且OGD/ZVAD/SB20

5、3580組較OGD/ZVAD組降低(P＜0.05)，與免疫熒光及細(xì)胞分泌LDH水平一致。同時(shí)結(jié)果顯示P38及SRF蛋白總蛋白水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)，其磷酸化水平在加入SB203580后下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、去泛素化酶CYLD存在于細(xì)胞核與細(xì)胞漿，且胞核強(qiáng)表達(dá)，胞漿弱表達(dá)，并且在胞質(zhì)中介導(dǎo)壞死樣凋亡的發(fā)生;2、SB203580對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)阻斷SRF的磷酸化水平，下調(diào)CYLD蛋白的表達(dá)，從而阻斷C