鹽酸13-己基小檗堿和鹽酸13-己基巴馬汀對(duì)NF-κB和p38MAPK信號(hào)通路的影響.pdf

1、炎癥相關(guān)性皮膚病在皮膚科發(fā)病率占據(jù)半數(shù)以上，以銀屑病、特應(yīng)性皮炎等為代表。目前認(rèn)為此類疾病是一種T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂性皮膚病，與活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的Th1型細(xì)胞因子(以TNF-α、IFN—γ為代表)密切相關(guān)。T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在炎癥性皮膚病中形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致其特有免疫病理損傷。核因子—kappa B(NF—κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，成

2、為炎癥性皮膚病發(fā)病機(jī)制及藥物治療靶點(diǎn)的研究熱點(diǎn)之一。TNF-α和IFN—γ是皮膚炎癥反應(yīng)中重要的病理因子，可引起角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的連鎖反應(yīng)，激活上述兩通路，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。 小檗堿系毛莨科黃連屬植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分，是傳統(tǒng)的抗菌藥物，有一定的抗炎等生物活性。鹽酸13—己基小檗堿(HB—13)是鹽酸小檗堿(BBR)的衍生物；巴馬汀(黃藤素)來源于黃藤等多種植物，鹽酸13—己基巴馬汀(HP—13)

3、是鹽酸巴馬汀的衍生物。HB—13和HP—13的結(jié)構(gòu)非常類似。前期研究表明，兩個(gè)化合物具有原代化合物(小檗堿和巴馬汀)所不具備的、或強(qiáng)度超過原代化合物的生物活性，如抗菌、抗皰疹病毒和抗炎活性等。 本研究以HB—13和HP—13為研究的目標(biāo)化合物，用來源于人正常皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞永生化株HaCaT細(xì)胞作為研究體系，探討HB—13和HP—13對(duì)TNF-α和/或IFN—γ引起的HaCaT細(xì)胞NF—κB信號(hào)通路和p38MAPK信號(hào)通路活化

4、的影響，并研究了兩化合物對(duì)T淋巴細(xì)胞活化及對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)功能的影響。 研究?jī)?nèi)容與結(jié)果分為三個(gè)方面： 第一章HB—13和HP—13對(duì)T淋巴細(xì)胞活化、對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞IL—8表達(dá)及對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響 通過體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞，用伴刀豆球蛋白A(ConA)作為刺激劑，用MTT法檢測(cè)HB—13和HP—13對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞活化的影響；通過rhTNF-α誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞，用ELISA測(cè)定HB—13和HP—1

5、3對(duì)rhTNF-α上調(diào)的細(xì)胞IL—8表達(dá)水平的影響；通過LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用ELISA檢測(cè)兩者對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，(1) HB—13在0.04875μg/ml～0.39μg/ml，HP—13在0.78μg/ml～3.12μg/ml濃度范圍內(nèi)抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，抑制率分別為12.7％—78.2％和14.3％—92.5％，抑制作用具有劑量依賴趨勢(shì)，IC50值約為0.123μg/ml和1

6、.563μg/ml；(2)HB—13和HP—13在0.39μg/ml～3.12μg/ml實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能明顯降低經(jīng)rhTNF-α上調(diào)的IL—8水平，IL—8表達(dá)抑制率約為85.7％—99.5％和68.4％—95.1％；(3)在0.01μg/ml～1μg/ml濃度范圍內(nèi)，HB—13對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)的抑制率超過50％，抑制作用有量—效趨勢(shì)，IC50值約為0.013μg/ml。1μg/ml HP—13能明顯抑制LP

7、S刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)，抑制率超過90％。 以上結(jié)果表明，HB—13和HP—13對(duì)T淋巴細(xì)胞活化及炎癥性細(xì)胞因子IL—8和IL-1β表達(dá)有抑制作用。 第二章 HB—13和HP—13對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞NF—κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響 通過體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞、外源性rhTNF-α或rhIFN—，γ誘導(dǎo)細(xì)胞IκB-α蛋白磷酸化，利用免疫印跡法檢測(cè)HB—13和HP—13對(duì)TNF-α或IFN—γ誘導(dǎo)的Ha

8、CaT細(xì)胞NF—κB活化的影響。結(jié)果顯示，(1) HB—13和HP—13在0.39μg/ml～1.56μg/ml濃度范圍內(nèi)抑制thTNF-α刺激引起的p—IκB-α表達(dá)，抑制率分別為47.4％—67.5％和32％—67.2％，抑制作用具有劑量依賴趨勢(shì)，IC50值約為0.441μg/ml和0.832μg/ml。(2)HB—13和HP—13對(duì)rhIFN—γ刺激引起的p—IκB-α表達(dá)也有抑制作用，在0.39μg/ml～1.56μg/ml濃度

9、范圍內(nèi)抑制率分別為37.8％—57.4％和37.5％—43.6％，抑制作用也呈一定的劑量依賴趨勢(shì)，IC50值分別為0.923μg/ml和4.556μg/ml。 以上結(jié)果表明，HB—13和HP—13對(duì)rhTNF-α和rhIFN—γ引起的HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞NF—κB活化均有抑制作用。 第三章 HB—13和HP—13對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響 通過體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，用外源性rhTNF

10、-α作為刺激劑誘導(dǎo)細(xì)胞p38MAPK蛋白磷酸化，利用免疫印跡法檢測(cè)HB—13和HP—13對(duì)TNF-α刺激的HaCaT細(xì)胞p38MAPK通路活化的影響。結(jié)果顯示，HB—13和HP—13在0.39μg/ml～1.56μg/ml實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)rhTNF-α刺激引起的p-P38的表達(dá)均無明顯抑制作用。 以上結(jié)果表明，HB—13和HP—13對(duì)rhTNF-α引起的HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞p38MAPK途徑的活化無明顯抑制作用。兩化合物的抗炎